2014 Fiscal Year Annual Research Report
局所微小力荷重下における近接場蛍光検出による生体組織の生理学応答分析装置の開発
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25286029
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
梅田 倫弘 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (60111803)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
太田 善浩 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (10223843)
岩見 健太郎 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80514710)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | オルガネラ / ベント型光ファイバー / 局所微小力 / 蛍光色素 / 共焦点顕微鏡 / ヤング率 / ナノニュートン / 活性酸素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細胞やオルガネラの力学刺激に伴う生理学応答を近接場光学顕微技術によって検出分析することで、これまで全く明らかにされてこなかった生体組織のダイナミクスを明らかにするとともに、それら生体組織を起源とする様々な疾病の機序の解明に迫ることができる分析システムの構築を目的とした。そのために、ベント型光ファイバーのたわみ変位を検出する微小力印加システムと生体組織の生理応答を光学的に検出する顕微システムを組み合わせた複合システムの開発を目指した。
H26年度では、前年度に開発した装置の一部の改良と、開発装置の有効性を実証するため、ミトコンドリアおよび大腸菌の力学特性および生理応答の観測実験を行い、以下の結果が得られた。
１）微小力印加に使われるベント型光ファイバーの製作方法として、フッ酸によるメニスカスエッチング法を使わずに超音波カッターによる製作方法を確立し、先端直径が5ミクロン程度の平坦構造を持つインデンターの開発に成功した。
２）製作した装置を用いてミトコンドリアの外部印加力に対する変形を測定し、ヤング率を世界で初めて計測することに成功した。また、ミトコンドリアへの栄養基質を添加したときの膜電位を同時に観測した結果、50nN以下の力印加では脱分極周波数が上昇することが明らかとなった。
３）開発した装置の有効性を実証するもう一つの試料として大腸菌に着目し、大腸菌の生死判定を蛍光色素により行った上で、ヤング率を計測した結果、生細胞は死細胞に比べて約10倍程度、ヤング率が大きいことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究は、ベント型光ファイバーによるナノニュートン程度の力をオルガネラに加えながらその組織の生理学応答を光学的に検出・評価するシステムを開発することを目的としている。
当初は、ベント型光ファイバーの製作法にフッ酸のメニスカスによる化学エッチングによって光ファイバーを加工し、先端直径が数ミクロンの平坦構造を持つインデンターを開発していたが、化学薬品の危険性、事後処理の問題および製作の歩留まりが10％と低いことが明らかとなったため、超音波カッター法に変更した。具体的には、光ファイバーを溶融延伸法で先鋭化させ、その先端から直径が数ミクロンの位置で超音波カッターにより破断させるというものである。これにより、ほぼ100％の製作再現性で平坦構造を先端に持つベント型光ファイバーを製作することが可能となった。
さらに、当初の計画では近接場光学系の導入と微小力印加系の複合化を目指していたが、昨年度の研究の進捗が想定より早かったので、今年度は、ミトコンドリアおよび当初計画していなかった大腸菌の力学特性の測定を試み、これまで報告されていなかった多くの知見を得ることに成功した。
したがって、当初の計画以上に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度では、前年度までに構築した光学系を用いて生体試料の力学特性と生理学応答の相関性を明らかにするすることで、開発した装置の有効性を実証するとともに、生物生体分野における新たな解析ツールの提供を目指す。
(1)細胞・オルガネラ試料としてミトコンドリアに注目する。ミトコンドリアには、呼吸基質を添加すると膨潤する体積調整現象が報告されている。この現象の機序を明らかにするために、ミトコンドリア内膜の内圧を計測しながら、膜電位を開発した装置で計測する。これによって体積膨潤現象のメカニズムが活性酸素の抑制のための防御機構として考えられていることの実験的裏付けとなることを示す。
(2)さらに、細胞へのダメージを与える活性酸素（ROS)の90％以上を産生すると言われるミトコンドリアに対して、物理ストレスを与えたときのミトコンドリアにおけるROS産生量を開発した装置で定量化し、ROS産生のミトコンドリアの寄与率を明らかにする。
(3)開発した装置の機能実証例として、大腸菌に着目し、その力学応答特性や活性度の違い、破壊強度の定量計測などを行うことで、排水処理施設における活性汚泥の減容化のための大腸菌の基礎的特性を提供する。
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