2013 Fiscal Year Annual Research Report
固相ゲル中結晶化法をベースとした複合体結晶構造解析の革新的技術開発
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25286051
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
杉山 成 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 特任准教授(常勤) (90615428)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 結晶工学 / 結晶成長 / タンパク質 / 固相ゲル / 創薬スクリーニング / SBDD / 脂質結合タンパク質 / 脂肪酸 |
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| Research Abstract |
固相ゲル中結晶化技術は、完全に固化したゲル中にタンパク質結晶を育成させる世界で初めてのタンパク質結晶化技術である。本技術の特徴は、タンパク質結晶の機械的強度を向上させ、その結果として有機溶媒に対する耐性を飛躍的に実現させたことにある。本研究では、従来法では実現できなかった、難水溶性化合物の溶解した高濃度有機溶媒へ、固相ゲル中で育成したタンパク質結晶を浸漬することにより、容易に複合体結晶を作製できる新規技術開発を目的とする。最終的に、本技術の特徴を活かし、高濃度有機溶媒に溶けた種々の難水溶性の脂肪酸リガンド溶液へ、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の結晶を浸漬し、得られた複合体結晶を精密に構造解析することで、これまで未解明であった脂肪酸分子認識の構造基盤とその生理的役割を解明する。本年度に実施した実験結果については以下の通りである。
固相ゲル中結晶化に使用する4種類の精製タンパク質サンプル（リゾチーム、エラスターゼ、グルコースイソメラーゼ、アビジン）の準備と脂肪酸結合タンパク質（FABP）の発現・精製プロトコールを構築した。また微量サンプルに対応するため、予め固相ゲルを結晶化プレートに数μLずつ塗布し、その上から結晶化溶液（タンパク質溶液と沈殿剤）を滴下することでゲル中に結晶を晶出させる技術開発にも成功した。さらに、予備的な実験ではあるものの、難水溶性化合物が溶解した50%DMSO溶液へ、固相ゲル中アポ型アビジン結晶を浸漬した後、構造解析したところ活性部位に化合物が結合していることを確認した。この結果は、高濃度有機溶媒に溶けた難水溶性化合物溶液へ固相ゲル中結晶を浸漬させることで複合体結晶が作製可能であること初めて示す結果となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
固相ゲル中結晶化に使用する4種類の精製タンパク質サンプル（リゾチーム、エラスターゼ、グルコースイソメラーゼ、アビジン）の準備と脂肪酸結合タンパク質（FABP）の発現・精製プロトコールを構築した。また微量サンプルに対応するため、予め固相ゲルを結晶化プレートに数μLずつ塗布し、その上から結晶化溶液（タンパク質溶液と沈殿剤）を滴下することでゲル中に結晶を晶出させる技術開発にも成功した。さらに、予備的な実験ではあるものの、難水溶性化合物が溶解した50%DMSO溶液へ、固相ゲル中アポ型アビジン結晶を浸漬した後、構造解析したところ活性部位に化合物が結合していることを確認した。この結果は、高濃度有機溶媒に溶けた難水溶性化合物溶液へ固相ゲル中結晶を浸漬させることで複合体結晶が作製可能であること初めて示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度以降は、固相ゲル中結晶を用いた浸漬技術を確立するために、モデルタンパク質として２種類のタンパク質（streptavidinとFABP）を用いる。具体的には、難水溶性化合物を有機溶媒に、それぞれ異なる濃度で溶解させた後、固相ゲル中結晶を浸漬させることで複合体結晶を作製する。Ｘ線回折実験（シンクロトロン放射光SPring-8とPFを予定）により構造解析を進め、活性部位に結合した化合物の有無を確認する。さらに、この技術開発を基に、難水溶性である鎖長の異なる脂肪酸(C10～C18)、不飽和度の異なる脂肪酸(C16:1, C18:1, C18:2, C18:3)、二重結合の構造異性体（trans不飽和脂肪酸）について、それぞれの複合体構造と結合親和性を網羅的に集積し、脂質分子の構造差異がタンパク質－脂質複合体構造に与える影響を調べ、FABPの脂質分子認識の構造基盤を明らかにすしていく予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究の進捗状況により初年度後半に購入を予定していた備品（クロマトグラフィー・GEヘルスケアÄKTA purifier 10）が機種変更などにより仕様と価格が大きく変更となり、今年度内での購入が困難となったため。
次年度の予算と合わせた新機種の購入を予定。
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[Journal Article] A novel approach for protein crystallization by a synthetic hydrogel with thermoreversible gelation polymer2013
Author(s)
Shigeru Sugiyama*, Noriko Shimizu, Gen Sazaki, Mika Hirose, Yoshinori Takahashi, Mihoko Maruyama, Hiroyoshi Matsumura, Hiroaki Adachi, Kazufumi Takano, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, and Yusuke Mori
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Journal Title
Cryst. Growth Des.
Volume: 13
Pages: 1899～1904
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Structure of the human heart fatty acid-binding protein in complex with the fluorescent probe 1-anilinonaphtalene-8-sulphonic acid2013
Author(s)
Mika Hirose, Shigeru Sugiyama, Hanako Ishida, Mayumi Niiyama, Daisuke Matsuoka, Toshiaki Hara, Eiichi Mizohata, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, Shigeru Matsuoka, and Michio Murata
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Journal Title
J. Synchrotron Radiat.
Volume: 20
Pages: 923～928
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] A New Approach for Protein Crystallization by Mebiol Hydrogel with Thermoreversible Gelation Polymer2013
Author(s)
S. Sugiyama, N. Shimizu, G. Sazaki, M. Hirose, Y. Takahashi, M. Maruyama, H. Matsumura, H. Adachi, K. Takano, S. Murakami, T. Inoue, and Y. Mori
Organizer
The International Conference on Structural Genomics 2013 (ICSG2013)
Place of Presentation
Sapporo, KEIO PLAZA hotel
Year and Date
20130729-20130801
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