2014 Fiscal Year Annual Research Report
固相ゲル中結晶化法をベースとした複合体結晶構造解析の革新的技術開発
| Project/Area Number |
25286051
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
杉山 成 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (90615428)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 結晶工学 / 結晶成長 / タンパク質 / 固相ゲル / 創薬スクリーニング / SBDD / 脂質結合タンパク質 / 脂肪酸 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
固相ゲル中結晶化技術は、完全に固化したゲル中にタンパク質結晶を育成させる世界で初めてのタンパク質結晶化技術である。本技術の特徴は、タンパク質結晶の機械的強度を向上させ、その結果として有機溶媒に対する耐性を飛躍的に実現させたことにある。本研究では、従来法では実現できなかった、難水溶性化合物の溶解した高濃度有機溶媒へ、固相ゲル中で育成したタンパク質結晶を浸漬することにより、容易に複合体結晶を作製できる新規技術開発を目的とする。最終的に、本技術の特徴を活かし、高濃度有機溶媒に溶けた種々の難水溶性の脂肪酸リガンド溶液へ、脂肪酸結合タンパク質（FABP）の結晶を浸漬し、得られた複合体結晶を精密に構造解析することで、これまで未解明であった脂肪酸分子認識の構造基盤とその生理的役割を解明する。本年度に実施した実験結果については以下の通りである。
固相ゲル中結晶を用いた浸漬技術を確立するために、モデルタンパク質として２種類のタンパク質（streptavidinとFABP）を用いた。難水溶性化合物（ビオチン誘導体と長鎖脂肪酸）が溶解した3種類の50%有機溶媒に、損傷を与えること無く固相ゲル中結晶を浸漬させることに成功し、さらにそれらの結晶を用いて結晶構造解析したところstreptavidinとFABPの活性部位に化合物が結合していることを確認した。これらの結果は、高濃度有機溶媒に溶けた難水溶性化合物溶液へ固相ゲル中結晶を浸漬させることで一般的に複合体結晶が作製可能であることを初めて示す結果となった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
固相ゲル中結晶を用いた浸漬技術を確立するために、モデルタンパク質として２種類のタンパク質（streptavidinとFABP）を用いた。難水溶性化合物（ビオチン誘導体と長鎖脂肪酸）が溶解した3種類の50%有機溶媒（dimethyl sulfoxide、dimethylformamide、エタノール）に、損傷を与えること無く固相ゲル中結晶を浸漬させることに成功し、さらにそれらの結晶を用いて結晶構造解析したところstreptavidinとFABPの活性部位に化合物が結合していることを確認した。これらの結果は、高濃度有機溶媒に溶けた難水溶性化合物溶液へ固相ゲル中結晶を浸漬させることで一般的に複合体結晶が作製可能であることを初めて示す結果となった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本技術を基に、鎖長の異なる脂肪酸(C10～C18)、不飽和度の異なる脂肪酸(C16:1, C18:1, C18:2, C18:3)、二重結合の構造異性体（trans不飽和脂肪酸）について、それぞれの複合体構造を網羅的に集積し、脂質分子の構造差異がタンパク質－脂質複合体構造に与える影響を調べ、FABPの脂質分子認識の構造基盤を明らかにする予定である。
|
| Causes of Carryover |
当初から、購入予定備品であったクロマトグラフィー・GEヘルスケアÄKTApurifier10が、大きく機種変更となったため、それに合わせて再度機種選定をしたことにより、最終的に価格差が生じたため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初予定よりも研究が進んでいるため、タンパク質の発現、精製、結晶化試薬等の消耗品に使用する予定である。
|
Research Products
(9 results)
-
-
[Journal Article] Water-mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by heart-type fatty acid-binding protein2015
Author(s)
Shigeru Matsuoka†, Shigeru Sugiyama†, Daisuke Matsuoka, Mika Hirose, Lethu Sébas-tien, Hikaru Ano, Toshiaki Hara, Osamu Ichihara, S. Roy Kimura, Satoshi Murakami, Hanako Ishida, Eiichi Mizohata, Tsuyoshi Inoue, and Michio Murata
-
Journal Title
Angew. Chem. Int. Ed.
Volume: 54
Pages: 1508-1511
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
-
[Journal Article] Crystallization and preliminary crystallographic studies of PotA, a membrane-associated ATPase of the spermidine-preferential uptake system in Thermotoga maritima2014
Author(s)
Shigeru Sugiyama*, Keiko Kashiwagi, Keisuke Kakinouchi, Hideyuki Tomitori, Ken Kanai, Michio Murata, Hiroaki Adachi, Hiroyoshi Matsumura, Kazufumi Takano, Satoshi Murakami, Tsuyoshi Inoue, Yusuke Mori and Kazuei Igarashi
-
Journal Title
Acta Crystallogr., F
Volume: 70
Pages: 738-741
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
-
-
-
-
-
-
