2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of systems for time-resolved intermolecular interaction detection during protein reactions and application to reaction mechanism
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25288005
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
寺嶋 正秀 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (00188674)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 分子間相互作用 / 拡散係数 / タンパク質 / 反応 / 時間分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質間相互作用は、生体分子の機能メカニズムを明らかにするために、非常に重要である。ここでは、これまで申請者が開発してきた独創的な過渡回折格子(TG )測定法を、もっと一般的な手法へと拡張することを目指した。TG 法をストップドフローシステムと組み合わせる場合に、通常のストップドフローシステムでは、大量のタンパク質溶液が必要となり、応用が困難であることがわかった。そのため、使用する溶液量を格段に減らすためのサンプルセルの工夫を行った。マイクロ流路を用いた結果、数マイクロリットルの溶液で高速混合し、TG信号を取れることに成功した。また、高速でサンプルを流すためのフローシステムの構築も行い、数100ミリ秒で乱流を押さえることに成功した。
この装置を用いて光センサータンパク質フォトトロピンの酸変性過程の時間分解検出を行った。酸性溶液と混合して光励起で拡散係数変化を追跡することができた。最初の100ミリ秒以内に大きな変性過程があり、それから数秒の時間で徐々に変性していく2段階の過程を検出することに成功した。この過程で反応分子と生成分子の拡散係数に変化はなかったので、2状態的に変性すること、酸変性によって反応効率が落ちていることなどがわかった。また、分子間相互作用を検出するために、ATPとの混合によって誘起される時計タンパク質KaiCの会合反応を調べた。その結果、7秒程度の会合を検出することに成功した。光トリガーでない会合反応をTG法でとらえたのはこれが初めてである。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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