2013 Fiscal Year Annual Research Report
ナノディスクを利用したミトコンドリア呼吸鎖における電子伝達機構の解析
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25288072
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
石森 浩一郎 北海道大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (20192487)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
内田 毅 北海道大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (30343742)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ナノディスク / 生体膜モデル / シトクロム酸化酵素 / MSP / 電子伝達系 |
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| Research Abstract |
平成25年度の研究実績の概要は以下の通りである．
① バクテリア型シトクロムc酸化酵素（CcO）を再構成したナノディスクの作成 直径10 nmのナノディスクに挿入するため，ウシ由来のCcOよりも小さく，サブユニット数が3個，分子量が25万程度の紅色細菌（Rhodobacter spheroides）の精製を試みた．イリノイ大Gennis教授から提供された発現系を用いて，このCcOの発現・精製を試みたが，発現効率が悪く，十分量の試料を確保するまでには至ってはいない．しかし，培養条件の検討により，収量は上昇しており，十分量の試料の確保については目途が立っている．また，本研究の結果を元に，同じくバクテリアである無毒化コレラ菌（Vibrio Cholerae）由来のCcOについても，ナノディスク化が可能であるということが明らかとなり，その発現系の確立とナノディスク化を検討している．
② 拡張型MSPの作成と哺乳類型CcOのナノディスク化 ウシ由来のCcOをナノディスクに挿入するため，一般的なナノディスク作成用の外枠蛋白質（MSP 1E3D1）をタンデムに連結したMSP (1E3D1)2を作成した．この拡張型MSP (1E3D1)2は標準型のMSP(1E3D1)に比べ発現効率は悪く，その安定性も高くないため，培養条件と精製手法の改良が必要である．また，ナノディスクに取り込む脂質についても検討を行い，本研究者により既にナノディスク化が確認されているハロロドプシンを用いたモデル実験において，鎖長や分岐個所の異なるいくつかの脂質を用いて検討を行った結果，疎水性鎖の分岐が少ないPOPCを用いた場合により天然に近い状態で蛋白質がナノディスクに取り込まれ，最も安定なナノディスクを形成することが明らかとなった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度の研究計画に対する達成度は以下の通りである．
① バクテリア型シトクロムc酸化酵素（CcO）を再構成したナノディスクの作成 バクテリア型のCcOのナノディスク化は平成26年にも引き続いて行うことが想定されていたので，平成25年度中にはナノディスク化にまでは至らなかったものの，バクテリア型のCcOの単離・精製に一定の目途が立ったので，当初の目的はほぼ達成できている．．
② 拡張型MSPの作成と哺乳類型CcOのナノディスク化 予想通り，拡張型MSPはその構造安定性が低いことが明らかになったが，ナノディスク化条件の検討により，当初想定したよりは少ない収量ではあるものの，少量ではあるが，拡張型ナノディスクの単離精製にめどがついた．したがってこの項目も当初の目標をほぼ達成できたと考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
ナノディスク化については，そのゲルろ過の結果により確認してきたが，より明確にナノディスク化を確認するため，平成25年度において予備的に用いた電子顕微鏡の利用を平成26年度は定期的に利用できるように計画している．また，拡張型MSPについては蛋白質としての安定性があまり高いことがないことから，低温誘導可能な発現系の構築も検討する予定である．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度に購入した培地用試薬について，一部の蛋白質発現系の効率向上により，予定よりやや少ない量で所定の試料を確保できたため，使用額が低く抑えることができた．
平成26年度は拡張型MSPなど発現効率の悪い蛋白質の単離・精製が予定されており，より多量の試料を確保するため，少しでも多くの培地用試薬が必要であることから，この培地用試薬の購入費に充当する．
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