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2014 Fiscal Year Annual Research Report

加齢性疾患にみられる蛋白質異常凝集の機構解明とその修復

Research Project

Project/Area Number 25288075
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

藤井 紀子  京都大学, 原子炉実験所, 教授 (90199290)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 加治 優一  筑波大学, 医学医療系, 准教授 (50361332)
大神 信孝  名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80424919)
Project Period (FY) 2013-04-01 – 2017-03-31
KeywordsD-アミノ酸 / 老化 / 蛋白質異常凝集 / 解離
Outline of Annual Research Achievements

蛋白質はL-アミノ酸のみから構成されているために正しい折りたたみ構造を形成し、その機能を発揮している。しかし、近年、白内障、加齢性黄斑変性症、アルツハイマー病、加齢性難聴等、種々の加齢性疾患の原因蛋白質中にD-β-アスパラギン酸(Asp)が蓄積していることが明らかとなってきた。蛋白質中にD-β-Aspが生成されると蛋白質の高次構造が乱れ、蛋白質の変性や異常凝集が起こる。上記の疾患では、蛋白質中でのD-β-Asp生成→D-β-Asp含有蛋白質の蓄積→蛋白質の異常凝集化、ならびに断片化→蛋白質の不溶化に至るが共通して生じている。本研究では蛋白質中でのD-β-Asp生成を加齢性疾患発症の一因と捉え、D-β-Asp含有蛋白質の微量定量分析の画期的な開発を行った。これにより、迅速、簡便な結合型D-アミノ酸分析が実現できた。また、水晶体蛋白質中の主成分であるα-クリスタリンにD-Aspが生成されると会合体として保持できず、解離することが判明した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

1)老人性白内障の水晶体をホモジェナイズし、遠心処理後、蛋白質を精製することなく、トリプシン処理し、液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)により、クリスタリン中のどのAsp残基がどの程度D-β-体化しているのかを微量試料で、簡便、迅速、精確に定量することに成功した。
2)蛋白質中に生ずるAsp残基の異性体はLα, Dα, Lβ-, Dβ-体の4種類存在する。これらは互いにジアステレオマーであるためにLC上で分離する。従って同一質量でLC上で複数のピークに分離しているペプチドがAsp異性体含有ペプチドであるので、この性質を利用して異性体の発見に成功した。これらのペプチドの同定は当初、4種類のAsp異性体を導入したペプチドを標品として化学合成し、その溶出時間を比較することにより決定していたが、時間とコストがかかることから、本年はAsp異性体を特異的に認識する酵素を作用させ、4種類の異性体の同定に成功した。
3)老人性白内障のα-クリスタリン、β-クリスタリンは通常、会合体を形成しているが、これらのクリスタリンはAsp残基が異性化することにより、会合体として存在できず、解離して単量体になることが初めて明らかとなった。

Strategy for Future Research Activity

本研究推進の成否は蛋白質中のD-β-Asp残基の分析をいかに、簡便に、精度よく、迅速に行うかにかかっている。従来法では蛋白質を精製し、酵素によってペプチドに断片化し、それらペプチドを加水分解し、ジアステレオマー法によってアミノ酸の光学異性体分析を行っていた。この分析法は時間がかかり、多くの試料の分析に適さない。そこで、今回、LC-MSと市販酵素の組み合わせにより、従来法とは全く異なる迅速簡便な定量法を確立させた。それにより従来分析が困難であった不溶蛋白質の分析も可能となった。この方法を利用し、他の加齢性疾患の蛋白質中のD-β-Asp残基を検出し、疾患の度合いとの関連について研究を進める。

Causes of Carryover

本研究の主力機器である液体クロマトグラフ質量分析装置のカラム、消耗品を本年度予算で購入の予定であったが、いずれも高価であるため、本年度は古いものでも使用可能であったので、これを購入しなかった。また、故障の際の多額の修理代も考慮していたが、今年度の維持、修理代は少額であった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

27年度以降、必要な時期に交換すべき消耗品を購入し、分析の向上を目指す。また、引き続き、使用期限がある消耗品の更新代を確保する。

  • Research Products

    (24 results)

All 2015 2014 Other

All Journal Article (7 results) (of which Peer Reviewed: 7 results,  Acknowledgement Compliant: 7 results) Presentation (15 results) (of which Invited: 3 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Rapid Survey of Four Asp Isomers in Disease-Related Proteins by LC-MS combined with Commercial Enzyme.2015

    • Author(s)
      Maeda H, Takata T, Fujii N, Sakaue H, Nirasawa S, Takahashi S, Sasaki H and Fujii N.
    • Journal Title

      Anal. Chem

      Volume: 87 Pages: 561-568

    • DOI

      10.1021/ac504413e

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] αB- and βA3-crystallins containing D-Aspartic acids exist in a monomeric state.2015

    • Author(s)
      Sakaue H, Takata T, Fujii N, Sasaki, H and Fujii N.
    • Journal Title

      Biochimica et Biophysica Acta -Proteins and Proteomics

      Volume: 1854 Pages: 1-9

    • DOI

      10.1016/j.bbapap

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] In vitro Amyloidogenic Peptides of Galectin-7: Possible Mechanism of Amyloidogenesis of Primary Localized Cutaneous Amyloidosis.2014

    • Author(s)
      Ono K, Fujimoto E, Fujimoto N, Akiyama M, Satoh T, Maeda H, Fujii N, Tajima S
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 289 Pages: 29195-29207

    • DOI

      10.1074/jbc.M114.592998

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Three cases of elastofibroma with immunohistochemical analysis of microfibrillar components.2014

    • Author(s)
      Ramkumar S, Fujii N, Fujii N, Thankappan B, Sakaue H, Ingu K, Natarajaseenivasan K, Anbarasu K.
    • Journal Title

      Mol Vis.

      Volume: 20 Pages: 1002-1016

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Effects of carotenoids on damage of biological lipids induced by gamma irradiation.2014

    • Author(s)
      Saito T. and Fujii N.
    • Journal Title

      Radiat. Phys. Chem.

      Volume: 98 Pages: 57-63

    • DOI

      10.1016/j.radphyschem.2014.01.009

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] D-アスパラギン酸が惹起するタンパク質の異常凝集と加齢性疾患2014

    • Author(s)
      藤井紀子
    • Journal Title

      Vitamins

      Volume: 88 Pages: 419-424

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] 白内障水晶体蛋白質中のアスパラギン酸残基の新しい異性体分析法2014

    • Author(s)
      藤井智彦、藤井紀子
    • Journal Title

      日本白内障学会誌

      Volume: 26 Pages: 33-36

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] ペプチド・蛋白質中の異性化したアスパラギン酸残基の新しい分析方法2015

    • Author(s)
      藤井智彦、岸本成史、藤井紀子
    • Organizer
      日本薬学会 第135年会
    • Place of Presentation
      神戸市
    • Year and Date
      2015-03-25 – 2015-03-28
  • [Presentation] 放射線照射によるシアル酸(Neu5Ac)の脱炭酸反応生成物ADOAの生成促進2015

    • Author(s)
      藤井智彦、飯島亮介、油井聡、藤井紀子、岸本成史
    • Organizer
      日本薬学会 第135年会
    • Place of Presentation
      神戸市
    • Year and Date
      2015-03-25 – 2015-03-28
  • [Presentation] LC-MSによる結合型D-アミノ酸分析2015

    • Author(s)
      藤井紀子、藤井智彦、高田匠
    • Organizer
      第40回生命の起原および進化学会学術講演会
    • Place of Presentation
      東京理科大学・葛飾キャンパス(東京都)
    • Year and Date
      2015-03-15 – 2015-03-17
  • [Presentation] ラット水晶体タンパク質に対するγ線照射の影響2015

    • Author(s)
      金仁求、 齊藤剛、藤井智彦、金本尚志、藤井紀子
    • Organizer
      第40回生命の起原および進化学会学術講演会
    • Place of Presentation
      東京理科大学・葛飾キャンパス(東京都)
    • Year and Date
      2015-03-15 – 2015-03-17
  • [Presentation] 結合型D-アミノ酸形成が誘起する水晶体蛋白質の不溶化2015

    • Author(s)
      高田匠、藤井紀子
    • Organizer
      第40回生命の起原および進化学会学術講演会
    • Place of Presentation
      東京理科大学・葛飾キャンパス(東京都)
    • Year and Date
      2015-03-15 – 2015-03-17
  • [Presentation] Isomerizations of aspartyl residues in lens crystallins from age-related cataracts2015

    • Author(s)
      Noriko Fujii, Takumi Takata, Norihiko Fujii, Hiroshi Sasaki
    • Organizer
      Asia ARVO 2015
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜(横浜市)
    • Year and Date
      2015-02-16 – 2015-02-19
    • Invited
  • [Presentation] Asp異性化がポリペプチド会合体へ及ぼす影響2014

    • Author(s)
      高田匠、藤井紀子
    • Organizer
      第87回日本生化学会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都市)
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] LC-MSを用いた皮膚蛋白質中のアスパラギン酸(Asp)残基の異性体分析2014

    • Author(s)
      鈴木 結、藤井 紀子、坂上 弘明
    • Organizer
      第87回日本生化学会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都市)
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] 放射線照射によるγークリスタリン中のアミノ酸残基の酸化2014

    • Author(s)
      金 仁求、高田 匠、齊藤 毅、藤井 智彦、藤井 紀子
    • Organizer
      第87回日本生化学会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館(京都市)
    • Year and Date
      2014-10-15 – 2014-10-18
  • [Presentation] アスパラギン酸残基の異性化によるクリスタリン会合体の解離2014

    • Author(s)
      藤井 紀子、 坂上弘明、 高田匠、 藤井智彦、佐々木 洋
    • Organizer
      第53回 日本白内障学会総会
    • Place of Presentation
      ガーデンシテイ品川(東京都)
    • Year and Date
      2014-09-27 – 2014-09-28
  • [Presentation] 水晶体蛋白質のアスパラギン酸残基の異性化と立体構造との関係2014

    • Author(s)
      藤井 智彦、 岸本 成史、 佐々木 洋、 藤井 紀子
    • Organizer
      第53回 日本白内障学会総会
    • Place of Presentation
      ガーデンシテイ品川(東京都)
    • Year and Date
      2014-09-27 – 2014-09-28
  • [Presentation] 皮膚蛋白質中のアスパラギン酸残基異性体と、紫外線による皮膚老化の関連性2014

    • Author(s)
      鈴木 結、坂上 弘明、藤井 紀子
    • Organizer
      第36回日本光医学・光生物学会
    • Place of Presentation
      大阪大学医学部学友会館・銀杏会館(大阪府)
    • Year and Date
      2014-07-25 – 2014-07-26
  • [Presentation] Deamidations In β-crystallin Family Are Highly Correlated With Lens Insolubulization During Aging2014

    • Author(s)
      T. Takata, N. Fujii, K. Lampi.
    • Organizer
      第14 回日本蛋白質科学会年会
    • Place of Presentation
      ワークピア横浜 / 横浜産貿ホール マリネリア(横浜市)
    • Year and Date
      2014-06-25 – 2014-06-27
  • [Presentation] 老化や酸化ストレスによるD-アミノ酸含有蛋白質の蓄積2014

    • Author(s)
      藤井紀子
    • Organizer
      第14回 日本抗加齢医学会総会 シンポジウム03糖化ストレス研究:老廃物の生成と分解を考える
    • Place of Presentation
      大阪国際会議場(大阪府)
    • Year and Date
      2014-06-08 – 2014-06-08
    • Invited
  • [Presentation] 加齢性眼疾患における蛋白質の変化をとらえる化学的アプローチ2014

    • Author(s)
      藤井 紀子
    • Organizer
      第118回日本眼科学会総会
    • Place of Presentation
      帝国ホテル(東京都)
    • Year and Date
      2014-04-02 – 2014-04-05
    • Invited
  • [Book] CSJ カレントレビュー17 「極限環境の生体分子―過酷な環境下での機能を科学する」放射線、紫外線照射、老化によるタンパク質への影響とその分析2014

    • Author(s)
      藤井紀子
    • Total Pages
      178
    • Publisher
      化学同人
  • [Remarks] 京都大学原子炉実験所藤井研究室論文・業績

    • URL

      http://hlweb.rri.kyoto-u.ac.jp/fl/works.html

URL: 

Published: 2016-06-01  

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