2013 Fiscal Year Annual Research Report
蛍光細胞分析分離装置と次世代シークエンンサを用いた水中生菌の網羅的解析技術の確立
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25289176
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | National Institute of Public Health |
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Principal Investigator |
秋葉 道宏 国立保健医療科学院, その他部局等, その他 (00159336)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岸田 直裕 国立保健医療科学院, その他部局等, 研究員 (10533359)
常田 聡 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (30281645)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 水道 / 微生物 / 遺伝子検査 |
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| Research Abstract |
本研究では、はじめに蛍光細胞分析分離装置を用いた水中に存在する生菌の分離手法について検討した。既往研究および染色キット記載のプロトコルを参考にして、環境微生物試料を対象に生菌・死菌染色を実施したが、蛍光顕微鏡による目視の観察では生菌・死菌サンプルの蛍光の差に大きな違いが見られなかった。蛍光細胞分析分離装置では、両者に蛍光の差は見られたものの、明確に分離されなかったため、染色条件の適正化が不可欠であると考えられた。また、実際に分離された試料を顕微鏡観察し、細胞数を計数した結果、装置上でのカウント数と必ずしも一致が見られなかったことから、装置上での分離条件についてもさらに検討を行う必要がある。
次世代シークエンサを用いた水中に存在する細菌の網羅的解析技術についても検討を行った。国内複数の水道水源、浄水場工程水を対象とした。ポリカーボネイト製のメンブレンフィルターを用いて細菌の濃縮を行った後、核酸を抽出した。16S rRNAを対象としたTailed PCRを実施した後、次世代シークエンス解析（アンプリコンシークエンス）に供した。その結果、試料の種類に係わらず、簡便に膨大な細菌叢の情報を得ることができた。微生物の多様性の指標であるChao１を用いて評価した場合、1試料あたり10万リード以上得ることで、その試料中に含まれるほとんどの細菌群を捉えることができることが分かった。97%の相同性でグルーピングした場合、１試料あたり約5,000 OTUsが得られた。また、浄水場工程水で見た場合、処理が進むにつれて多様性が低下したことから、水道原水中に除去されやすい細菌とされにくい細菌が存在しており、されにくい細菌がろ過池から流出していると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
蛍光細胞分析分離装置を用いた水中に存在する生菌の分離手法については、検討を進めているものの、必ずしも当初の研究実施計画通りには研究は進展していない。既往文献に記載された実験条件を参考に検討を進める予定であったが、生菌・死菌染色を実施した際に、生菌・死菌サンプルの蛍光の差に大きな違いが見られなかった。このため、染色剤の種類や染色条件を変更して検討を行ったが、今年度の検討では生菌・死菌を明確に分離する実験条件を確立するには至っていない。
次世代シークエンサを用いた水中に存在する細菌の網羅的解析技術については、当初の研究実施計画以上に研究が進展している。16S rRNAを対象としたTailed PCRに供するDNA量等について検討した結果、実験条件を適正化することに成功しており、ポリカーボネイト製のメンブレンフィルターを用いて大量の試料水を濃縮し、核酸を抽出した後に、Tailed PCR、次世代シークエンス解析（アンプリコンシークエンス）に供する手法は、水試料中の細菌叢の網羅的解析に効果的であることがわかった。また当初の予定以上に様々な水試料を入手し、本手法を適用した結果、適用性の高さを証明することができた。また、真核藻類が保持している葉緑体に存在している16S rRNAを同時に増幅し、解読することで、細菌のみでなく真核藻類も同時に検出することが可能であり、細菌以外の微生物叢の情報入手にも成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光細胞分析分離装置を用いた水中に存在する生菌の分離手法については、引き続き染色条件や装置上での分離条件に関する検討を進める予定である。その際、染色条件・染色剤選定の参考となる研究論文が年度末に発表されたことから、次年度はこの論文を参考に実験条件の適正化を行いたいと考えている。装置自体の変更についても視野に入れているが、どうしても蛍光細胞分析分離装置を用いた生菌の分離手法が確立できない場合は、次世代シークエンサを用いた網羅的解析技術を中心に研究を進めていきたいと考えている
次世代シークエンサを用いた水中に存在する細菌の網羅的解析については、本年度確立した手法を用いて多くの水試料中の微生物叢を調査したいと考えている。水道水源に存在する微生物叢の季節変動や、水質や浄水場の運転条件と工程水中の微生物叢の関連性等について精力的に調査する予定である。また、本研究で確立した新規手法と、培養法・ノーマルシークエンスを利用した従来の分析・解析手法とで、作業の迅速性・微生物叢の多様性等の観点から結果を比較することで、新規手法の水試料中における微生物叢解析の有用性を調査する予定である。従来法では、はじめに培養によって生菌コロニーを分離する必要があるが、本研究では、水道水質基準および管理目標項目となっている「一般細菌（36℃、1日）」および「従属栄養細菌（20℃、1週間）」の培養条件を参考として、一部修正を行いながら生菌のコロニーを分離する予定である。また、ノーマルシークエンスに供する試料数は、作業性を鑑みて1水試料あたり48試料（リード）とする。なお、PCRを利用した手法は、核酸増幅時に微生物種毎にバイアスが生じやすいことが知られているため、内部標準等を利用してこのバイアスを補正する手法についても検討する予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究費の効率的な使用により、残額が発生したため。
前年度未使用額（残額）は、適用試料数を増加させることで発生する消耗品代に充てる予定である。
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Research Products
(2 results)
