2015 Fiscal Year Annual Research Report
蛍光細胞分析分離装置と次世代シークエンンサを用いた水中生菌の網羅的解析技術の確立
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25289176
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| Research Institution | National Institute of Public Health |
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Principal Investigator |
秋葉 道宏 国立保健医療科学院, その他部局等, その他 (00159336)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岸田 直裕 国立保健医療科学院, その他部局等, その他 (10533359)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 水道 / 微生物 / 遺伝子検査 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
水道水源や飲料水、医療用水等における細菌叢（種類）やその存在量を正確に把握することは、我が国における水衛生の健全性を鑑みた上で極めて重要な課題である。水中の細菌叢の解析は、従来、分離培養および培養後の微生物の遺伝子解析に依存した手法によって実施されてきたが、分離培養困難な微生物が多いこと、また検査に長期間を要することから、特に水道分野においては、網羅的な解析が行われていないのが現状である。そこで本研究では、分離培養に依存しない解析手法として、蛍光細胞分析分離装置（FACS）および次世代シークエンサーに着目し、水中の細菌叢の網羅的解析技術を確立することを目的としている。本年度は、昨年度に引き続き、主に次世代シークエンサーを用いた細菌叢の解析技術について検討を行った。
国内の水源貯水池、浄水場等から採取した水試料を試験対象とした。ポリカーボネイト製のメンブレンフィルターを用いて細菌の濃縮を行った後、CTAB法等によりゲノムDNAを抽出した。16S rRNAを増幅対象としたTailed PCRを実施した後、次世代シークエンス解析（アンプリコンシークエンス）に供した。データ解析には、16S rRNA菌叢解析のパイプラインとなっているQIIMEを用いた。複数の試料水における細菌叢・存在量を上記手法で網羅的に調査した結果、採水地点、時期によって微生物群集構造が大きく異なることを定量的に示すことができた。また、同じ属であっても種や株によって、水中での挙動が異なることが明らかとなった。浄水処理工程で除去されづらい細菌種の存在を明らかとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
蛍光細胞分析分離装置を用いた水中に存在する生菌の分離手法については、検討を進めているものの、必ずしも当初の研究実施計画通りには研究は進展していない。既往文献に記載された実験条件を参考に検討を進めたが、生菌・死菌染色を実施した際に、生菌・死菌サンプルの蛍光の差に大きな違いが見られなかった。このため、染色剤の種類や染色条件を変更して検討を行ったが、生菌・死菌を明確に分離する実験条件を確立するには至っていない。
次世代シークエンサーを用いた水中に存在する細菌の網羅的解析技術については、ある程度計画通りに進展している。ポリカーボネイト製のメンブレンフィルターを用いて大量の試料水を濃縮し、核酸を抽出した後に、Tailed PCR、次世代シークエンス解析（アンプリコンシークエンス）に供する手法は、水試料中の細菌叢の網羅的解析に効果的であることが証明された。また昨年度以上に多様な水試料を入手し、本手法を適用した結果、適用性の高さを証明することができた。一方、分離培養法およびノーマルシークエンサを用いた従来法と試験結果を比較する予定であり、今年度も試みてはいるが、十分に比較可能なデータを入手するには至っていないことから、次年度に行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、今年度までに十分なデータを取得することができなかった、次世代シークエンサーを用いた新規手法と分離培養法・ノーマルシークエンスを利用した従来の分析・解析手法との比較を主に実施する。作業の迅速性・微生物叢の多様性等の観点から結果を比較することで、新規手法の水試料中における微生物叢解析の有用性を調査する予定である。従来法では、はじめに培養によって生菌コロニーを分離する必要があるが、本研究では、水道水質管理目標設定項目となっている「従属栄養細菌（R2A培地、20℃、1週間）」の培養条件を参考として、一部修正を行いながら細菌のコロニーを分離する予定である。分離後にDNAを抽出してから、次世代シークエンス解析と同様に16S rRNAを増幅対象としたPCRを行い、産物を精製した後に、ノーマルシークエンスに供す予定である。十分な試験結果の比較が可能なように、できるだけ多くの水試料を対象として試験を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
研究費の効率的な使用により、残額が発生したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度未使用額（残額）は、従来法との比較実験のための消耗品代、研究協力者への謝金等に使用する予定である。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Community analysis of picocyanobacteria in an oligotrophic lake by cloning 16S rRNA gene and 16S rRNA gene amplicon sequencing.2015
Author(s)
Fujimoto N, Mizuno K, Yokoyama T, Ohnishi A, Suzuki M, Watanabe S, Komatsu K, Sakata Y, Kishida N, Akiba M, Matsukura S.
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Journal Title
J Gen Appl Microbiol
Volume: 61
Pages: 171-176
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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