2014 Fiscal Year Annual Research Report
5-HT2C受容体のRNA編集によるストレス・情動調節機構の機能形態学的研究
| Project/Area Number |
25290014
|
|---|
| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
田中 雅樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80264753)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田口 勝敏 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60462701)
吉本 寛司 広島工業大学, 生命学部食品生命科学科, 教授 (70111903)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | RNA編集 / 5-HT2C / アルコール / 情動 / ADAR2 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は慢性ストレスモデルやRNA 編集異常を起こした遺伝子改変マウスを用いて、セロトニン２C 受容体(5-HT2CR)とそのRNA 編集がストレス・情動反応にどのように関与するか解明することを目的としている。
１．慢性アルコール暴露モデルによるRNA編集検索： H25年度までの研究により、慢性アルコール暴露後の側坐核や背側縫線核における5-HT2CRのRNA編集頻度の上昇がマウスのアルコール嗜好性を規定していることが明らかになった(Int J Neuropsychopharmacol 2014)。H26年度では脳のどの領域のRNA編集変化が依存形成に関わるのか調べるために、前脳側坐核のRNA編集酵素ADAR2をノックアウト(KO)する準備を開始した。ADAR2 floxマウスを本学に導入して、局所的にADAR2をKOさせるためAAV-Creウイルスベクターを構築した。ウイルスベクターにはGFP遺伝子も挿入されており、感染部位をGFP蛍光または抗GFP抗体で確認が出来、現在側坐核感染のための条件設定を行っている。
２．遺伝子改変マウスにおける情動検索
H26年度は5-HT2CRのRNA編集が起きないINI型マウスと全ての編集部位で編集が起きたVGV型のマウスの脳の各部位におけるセロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリン等モノアミンを定量した。その結果INIマウスで側坐核におけるセロトニンが有意に対照群より減少していた。さらに行動解析を行うと強制水泳試験でINIマウスは有意に無動時間が増加しており、抗うつ剤(Desipramine)投与により改善がみられた。このマウスは野生型に比べてうつ様状態にあることが考えられ、現在このINIマウスの情動異常の原因探索に焦点を絞って検索を進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H26年度は以下に述べる、大きく２つの研究を実施した。昨年度の今後の推進方策に沿った研究を行っており、概ね順調に進展していると考えている。
１．遺伝子改変マウスを用いた脳部位特異的なADAR2局所ノックアウトの試み:２５年度までの研究により慢性アルコール暴露マウスモデルでアルコールに対する嗜好性上昇が側坐核の5-HT2CR RNA 編集程度と編集酵素の増加に由来することを証明でき論文発表したが、昨年度の今後の推進方策にも記した通り、局所領域におけるRNA編集酵素を操作するための研究を開始した。様々なアプローチを調べて、ADAR2 flox マウスが作製されているので、このマウスを用いてAAV-Creウイルスベクターを作製して脳局所に注入感染させて、ADAR2をノックアウトさせる方式を採用した。マウスは東京大学との共同研究で提供を受け現在ウイルスベクターを構築して感染実験を行っている。
２．遺伝子改変マウスにおける情動検索:H26年度は5-HT2CRのRNA編集が起きないINI型マウスと全ての編集部位で編集が起きたVGV型のマウスの脳の各部位（側坐核、線条体、扁桃体、前頭葉大脳皮質、視床下部、背側縫線核）におけるセロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリンおよびドーパミン代謝産物DOPACを定量した。その結果INIマウスで側坐核におけるセロトニンが有意に対照群より減少していた。さらに行動解析を行うと強制水泳試験でINIマウスは有意に無動時間が増加しており、抗うつ剤(Desipramine)投与により改善がみられた。このマウスは野生型に比べてうつ様状態にあることが考えられ、現在このINIマウスの情動異常の原因探索に焦点を絞って検索を進めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究実績の概要にも述べたが、H26年度に行った２つの研究結果をふまえて、それをさらに推進させる予定である。
１．遺伝子改変マウスを用いた脳部位特異的なADAR2局所ノックアウトの試み
ADAR2 floxマウス側坐核にAAV-Creを感染させ、実際に感染局所のRNA編集がどのように変化するかを調べる。まずADAR2単独で編集されるグルタミン酸受容体(GluR2)で調べ、次に5-HT2CRで検索を行う。予備実験でパンチャーによるRNA編集頻度を検索したが、コントロールと有意な変化が取れず、AAV感染細胞のみをレーザーマイクロダイセクション法を用いて切り取り、RNAを抽出する計画を立てている。
２．INIマウスにおける情動検索
現在INIマウスでは強制水泳試験でうつ様行動がみられ、側坐核ではセロトニン含有量が低い結果が出ている。側坐核がうつ様行動を示す原因部位として注目されるが、このINIマウスと野生型マウスの側坐核や扁桃体等情動に関与が疑われる遺伝子、CRF,NPY, BDNFとその受容体についてもRTPCRにより検索を行う。 もし変動がみられる因子が同定されれば、その因子および受容体のアゴニスト、アンタゴニストを局所投与してうつ様行動がどのように変化するか検索を進める予定である。
|
| Causes of Carryover |
注文した試薬（抗体）が国内に在庫がなく海外発注となり、納期が遅れるため、次年度使用額として充てることにした。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度遂行の試薬等消耗物品費として使用する予定である。
|
