標的細胞中で発現しない非コードＲＮＡ遺伝子をトラップする手法の開発

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25290034
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 石田 靖雅 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (10221756)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: リサーチバイオリソース / ES細胞 / 遺伝子トラップ / ジフテリア毒素 / NMD / ノックアウトマウス

Research Abstract

DTrapベクターの両端に、プロモーターを持たないジフテリア毒素（フラグメントA）遺伝子のカセットを配置した。ジフテリア毒素遺伝子としては、野生型に比べ酵素活性が約1/30に減弱されたバリアント「tox-176」を用いた。このベクターとマウス未分化ES細胞を用いて遺伝子トラップを行い、数百個のES細胞クローンを得た。その中から数個を選び、それぞれに対してFlp発現ベクター（FLPo）を一過性に導入し、FRT-FRT間とF3-F3間で、同時に2種類の並行した相同組換えを引き起こした。組換え後のベクター内部には、FRTとF3が一個ずつ残存したが、それらの間で組換えが引き起こされることはないため、EGFPカセットがさらに反転を繰り返すことはなかった。上記のベクターで実施した遺伝子トラップ実験では、約6割のクローンにおいてES細胞中で発現しない遺伝子がトラップされていた。しかしながら、約3割のクローンでは、ベクター内のNEO pre-mRNAが、すぐ下流のDTカセット（アンチセンス鎖）の内部にスプライスされることが判明した（DTカセットのアンチセンス鎖には、複数のクリプティックなスプライス・アクセプターが存在することが示された）。そのままでは、実際に遺伝子をトラップしていない場合でも、あたかもトラップに成功したかのような結果が出てしまうため、対策として、遺伝子トラップのためのNEOカセットを、2番目のDTカセットのさらに下流に移動した。この変更により、NEOカセット内のスプライス・ドナーは、必ずベクターの外側に存在する内在性遺伝子へとスプライスされるようになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究は、ほぼ予定通りに進行している。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度と27年度も、当初の予定通りに研究を進める。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

H26年の3月に行う予定だった実験を、実際にはH26年の4月から5月にかけて行うことになった。そのため、その実験に必要な試薬と消耗品を購入するための費用が、次年度であるH26年度に使用されることになった。
H26年の3月に行う予定だった実験を、実際にはH26年の4月から5月にかけて行うことになった。そのため、その実験に必要な試薬と消耗品を購入するための費用は、H26年度の4月と5月に使用する。これは極めて軽微な変更点であり、研究計画全体には全く影響を及ぼさない。