2013 Fiscal Year Annual Research Report
次世代型ターゲットトランスジェニック法の技術基盤の整備と実用性の検証
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25290035
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
大塚 正人 東海大学, 医学部, 講師 (90372945)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
持田 慶司 独立行政法人理化学研究所, 遺伝工学基盤技術室, 専任技師 (60312287)
設楽 浩志 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術研究センター, 基盤技術研究職員 (90321885)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ターゲットトランスジェネシス / C57BL/6N / PITT / Cre-loxP / PhiC31 / Rosa26 |
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| Research Abstract |
平成２５年度の研究成果は以下の通りである。
１）B6背景の新しい種マウスを用いたPITT法の確立。新たに作製したC57BL/6N背景の種マウスを用いたPITT法の各種条件設定を行った。様々な濃度のCreやΦC31 mRNAを注入し、それぞれの最適濃度を求めることができた。また、本マウスを用いて実際にPITT法でターゲットTgマウスを作製することに成功した。既に３系統以上のTgマウスを作製・維持している。
２）誘導型遺伝子発現Tgマウス作製。PITT法を利用し、ドキシサイクリン(Dox)誘導型遺伝子発現Tgマウスを作製するための、誘導型種マウスを作製することができた。本マウスは、ホモとして系統維持している。次年度には、これを用いて実際に誘導型遺伝子発現Tgマウスを作製する予定である。
３）CRISPRを用いた受精卵での遺伝子改変によるHprt種マウス作製。まずCRISPRの系の確立を行った。Cas9 mRNAと、Hprt座位上流をターゲットとしたsgRNAを調製し、C57BL/6Nマウスの受精卵に注入してblastocystまで培養した。胚からDNAを回収してPCRを行うことで、ターゲット座位に変異が生じていることを確認した。
４）東海大学外施設におけるPITT法の実施。分担研究者である持田博士が所属する施設で、PITT法を行った。その為に、C57BL/6N背景種マウスの精巣上体尾部を冷蔵輸送し、IVFで得られた受精卵に、ドナーベクターの顕微注入を行った。13.5日胚を回収して遺伝子挿入の有無を確認した結果、ターゲットTgマウスの存在を確認することができた。これは、東海大学外施設におけるPITT法の初めての成功例である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
殆どの実験計画を予定通りに進めることができた。世界標準系統であるC57BL/6N系統の種マウスを用いたPITT法については、条件検討を完了し、既に実際に複数のTgマウスを作製できている点で、予定よりも進展していると言える。また、条件検討が必要と思われた精巣上体尾部での冷蔵輸送によるPITT法については、初めての挑戦で成功している。一方、マウスの譲与に要する事務的な書類の準備が遅れていたことにより、他施設でのPITT法の実施の一部が遅れている部分もある。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、平成２５年度に得られた研究成果を発展させ、各種ツールの改良と遺伝子挿入効率の改善、誘導型遺伝子発現Tgマウス作製系の開発、Hprt種マウス作製、東海大学外施設でのPITT法の実施、を進める予定である。
１）各種ツールの改良と遺伝子挿入効率の改善。ドナーベクターの改良を行うこと、組換え酵素を組み合わせて使用することにより、作製したC57BL/6N背景の種マウスを用いたPITT法の更なる効率改善を試みる。またそれを用いて実際に複数のTgマウス作製を行う。
２）誘導型遺伝子発現Tgマウス作製系の開発。平成２５年度に作製した誘導型種マウスを利用して実際にレポーター遺伝子発現Tgマウスを作製し、その検証を行う。
３）Hprt種マウス作製。平成２５年度に設計したsgRNAを用いて、PITT法用のタグを付加した新たな種マウス（Hprt座位）作製を行う。
４）東海大学外施設でのPITT法の実施。分担研究者の協力のもとに、東海大学外施設でのPITT法を複数実施し、標準プロトコルの作製を目指す。
以上が本研究のメインの計画であり、特に変更点や研究を遂行する上での課題等はない。可能であれば、計画に予定している施設以外の外部施設（海外も含め）にも種マウスを分与していきたいと考えている。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究を遂行するにあたり、実験補助員の雇用が必要となる。平成２５年度は学生のサポートがあったため、雇用は必ずしも必要ではなかった。次年度以降に雇用が必要となると考えられる。また、平成２５年度は新たに作製した種マウスを用いたPITT法の条件検討を行ったが、その導入効率等の解析を着床前胚で行う系を確立したため、Tgマウス個体を得る必要性がなくなった。
平成２６年度以降には、前年度までに作製した種マウスを用いて当初の予定よりも多くのTgマウス作製とその解析を行うことを計画しており、Tgマウス作製費用、飼育維持費用として使用する予定である。また、各種リソースの開発と作製したTgマウスの維持解析を行う人材が必要であり、そのための人件費として使用する予定である。
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