2015 Fiscal Year Annual Research Report
次世代型ターゲットトランスジェニック法の技術基盤の整備と実用性の検証
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25290035
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
大塚 正人 東海大学, 医学部, 准教授 (90372945)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
持田 慶司 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソースセンター, 専任技師 (60312287)
設楽 浩志 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術研究センター, 主任基盤技術研究職員 (90321885)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | トランスジェニック / Cre-loxP / PhiC31 / PITT法 / 組織特異的プロモーター / Rosa26 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）我々は、PITT法を用いて、Cre-loxP組換えによる時期組織特異的な発現とDox誘導型発現を同時に可能とするTgマウス作製法の確立を目指している。具体的には、TRE-CAG-loxP-eGFP-pA-loxP-lacZ-rox-IRES-tTR/KRAB-pA（アリル２）配列をRosa26座位に有するTgマウスを作製し、Cre発現マウスと交配してloxP間が除去されたTRE-CAG-loxP-lacZ-rox-IRES-tTR/KRAB-pA（アリル３）マウスについてDox誘導型発現の有無を検証する予定であった。実際にアリル２の前段階であるTRE-CAG-loxP-eGFP-pA-loxP-lacZ-rox-loxP-tdTomato-rox-IRES-tTR/KRAB-pA（アリル１）を有するマウスを得ることに成功したが、このマウスからアリル２マウスを得ることができなかった。その理由は、Dre発現マウスが6月以降出産をせず、次世代が得られなかったためである。最近当該マウスが出産したため、引き続き進める予定である。
２）最近はCRISPR法で任意の座位へのノックインが可能になったものの、未だ5kb以上の配列の挿入は困難である。一方、PITT法では15kbくらいまでの挿入に成功していることから、大きな配列の挿入にはPITT法が適していると言える。しかし、これまでPITT法で挿入可能な遺伝子座位はRosa26のみであった。そこで、変異loxPやattP等のタグをHprt座位上流にノックインすることを計画した。短い配列の挿入はCRISPR系が適していると考え、タグを含むssDNAをCRISPR関連核酸と混合して受精卵に注入した。20匹の仔が得られたためタイピングを行ったところ、複数のssDNA挿入胚が得られたものの、残念ながら、全てにおいて挿入配列が正確ではなかった。
残念ながら繁殖効率等の問題により予定通りに進められなかったものの、PITT法に関する論文を複数発表することができた。
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| Research Progress Status |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(11 results)
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[Journal Article] One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT)2015
Author(s)
Ohtsuka M., Miura H., Mochida K., Hirose M., Hasegawa A., Ogura A., Mizutani R., Kimura M., Isotani A., Ikawa M., Sato M. and Gurumurthy C. B.
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Journal Title
BMC Genomics
Volume: 16
Pages: 274
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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