2013 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
25290046
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
|
| Research Institution | Japanese Foundation for Cancer Research |
|---|
Principal Investigator |
高橋 暁子 公益財団法人がん研究会, がん研究所がん生物部, 主任研究員 (60380052)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 細胞老化 / がん抑制機構 / SASP |
|---|
| Research Abstract |
ヒト正常線維芽細胞株（TIG-3, Hs68, IMR90）、ヒト正常上皮細胞株（RPE, NHEK, NHEM）、マウス正常線維芽細胞株（MEF）を継代培養するか、もしくは活性化型Rasの過剰発現やDNA損傷ストレス（X線照射）によって細胞老化を誘導し、48時間培養した上清を回収し、超遠心法でエクソソームを分離後にNanoSightを用いて回収したサンプルの粒子径を測定すると同時に、透過型電子顕微鏡（TEM）観察を行いエクソソームが回収されていることを確かめた。この時、細胞老化をおこした細胞では、１細胞あたりのエクソソームの分泌量が増加していることが明らかとなった。さらに単離した分泌膜小胞をCD63抗体を用いた免疫電子顕微鏡法による観察を行い、エクソソームマーカー蛋白を発現していることを確認した。
次に、上記の方法で回収したエクソソームサンプルをLC/MS法により解析し、細胞老化の誘導前後でエクソソームに含まれる蛋白成分がどのように変化するのかを明らかにした。
また、mirVana miRNA Isolation Kit (Applied Biosystem社)を用いてエクソソームRNAを調整し、qRT-PCR法によって細胞老化特異的に分泌量が増加しているエクソソームRNAを明らかにした。
このように、初年度の研究により細胞老化をおこした細胞ではエクソソームの分泌量が増加していること、またエクソソームに含まれる蛋白やRNAのプロファイルが変化していることが明らかとなった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は当初の目標であった老化細胞が分泌するエクソソームのプロファイルを明らかにすることができた。NanoSightや電子顕微鏡を用いた観察から老化細胞が分泌するエクソソーム量が増加することが明らかとなり、さらにLC/MS法やqPCR法を用いた解析から、老化細胞で特異的に分泌量が増加しているエクソソーム蛋白やエクソソームRNAを明らかにすることができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、本年度明らかにした老化細胞で特異的に分泌量が増加しているエクソソーム蛋白とエクソソームRNAに着目し、正常細胞にDNA損傷応答を引き起こし、細胞分裂に異常を生じさせる原因因子を明らかにすることを目指す。
|
