2013 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子修復治療を目指した化学的RNA Editing法の確立
| Project/Area Number |
25290072
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
|
| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
塚原 俊文 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (60207339)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤本 健造 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (90293894)
鈴木 仁 北陸先端科学技術大学院大学, ナノマテリアルテクノロジーセンター, 助教 (00447690)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 疾患治療 / 点変異 / RNA Editing / 脱アミノ化 / 蛍光タンパク質 / 遺伝コード修復 / RFLP / 恒常発現細胞株 |
|---|
| Research Abstract |
本研究は、RNA Editingと同様の反応を人為的に再現することで、点変異したRNAを標的に、細胞内で部位特異的な脱アミノ化を誘起し、遺伝コードを変換・修復する方法を確立することを目的とする。具体的にはGFP遺伝子の199T>C変異がBFPとなることに注目し、BFPの恒常発現細胞に部位特異的な脱アミノ化を誘起させ、199C>UとしてGFPとする方法の確立を目指している。
まず、GFP199T>C変異体が青色蛍光を発することを確認し、BFP遺伝子プラスミドを構築した。これまでの研究結果を基に、BFP-mRNAを対象に199Cを脱アミノ化するための人工ODNを設計し、合成した。2種のCNVK含有ODNと7種のCVU含有ONNはBFP-mRNAに相補的に結合し、官能基CNV又はＣＶを標的となる199C近傍に提示する設計となっている。人工合成した100merの１本鎖BFP-ODNを標的として、上記9種のODNの光重合、光解列の条件を検討し、最適な光重合・解列の条件を調べた後、実際に部位特異的な光化学的脱アミノ化を試みた。脱アミノ化の有無は、PCR-RFLPによって確認した。
CNVK含有ODNを用いた実験では、90度C、2時間の処理により、40%程度のBFP-ODNでC>U変異修復が確認されたが、37度Cでは10時間以上の処理でも変異修復が見られなかった。一方、CVU含有ODNでは、90度C処理ではCNVK含有ODNに比して変異修復効率が低いものの、長時間の37度C処理によって6%の変異修復が確認された。脱アミノ化誘起ODNの相補鎖長やヘアピン長によって変異修復効率が異なるため、これらの最適化によって、より高い修復効率が得られると期待される。
また、これまでにBFPプラスミドをHEK293細胞に導入して恒常発現細胞株を樹立し、細胞内遺伝子修復研究のための実験系の確立にも成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、CVU含有ODNを用いる事で、長時間の37度C処理によってBFPの変異修復が確認された。また、変異修復効率が脱アミノ化誘起ODNの相補鎖長やヘアピン長と変異修復効率の相関性も明らかにし、より高い修復効率を得るためにODNの最適化が可能となった。また、BFPプラスミドをHEK293細胞に導入して恒常発現細胞株を樹立し、細胞内遺伝子修復研究のための実験系の確立にも成功した。In vitro転写によって全長のBFP-mRNAの合成にも成功しており、BFP-mRNAを標的に用いた変異修実験に取り組んでいるところである。一方、共同研究者の藤本らは、光架橋させることで酵素耐性を持つ３重鎖DNA構造の構築にも成功しており、この技術を応用することで、ODNの細胞内持続性が飛躍的に増大すると期待される。従って、in vitroでの化学的RNA Editingの段階はほぼ完了し、BFPの発現細胞を用いたin vivoでの実験に移る準備ができたと考えている。
今後は、細胞内でのBFP199C>Uの変異修復研究に注力し、光化学的RNA Editingによる遺伝コード修復法の確立を目指すものである。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１本鎖BFP-ODNを標的とした実験で変異修復が確認されたため、今年度はBFP-mRNAを標的としたin vitroの変異修復研究を行う。BFPプラスミドからin vitro転写を行う事でBFP-mRNAを調製し、これを標的として化学的RNA Editingを試みる。変異修復の有無はRT-PCR-RFLPによって確認し、相補鎖やヘアピン長等を最適化した脱アミノ化誘起ODNを検索する。
続いて、樹立したBFP恒常的発現細胞株を用いた、変異修復実験を行う。脱アミノ化誘起ODNをBFP発現細胞に導入し、細胞内でのC>U点変異による遺伝コード修復が可能か否かを検討する。脱アミノ化に必要な熱処理に関しては、CVUについては既にin vitroで37℃でも長時間の反応によって変異修復が認められており、光照射による脱アミノ化誘起ODNのターゲットへの結合後、数日間の培養によって細胞内での脱アミノ化反応が自動的に進行すると考えている。遺伝子修復の有無についてはPCR-RFLPや塩基配列決定によって分子レベルで確認できる。修復効率が高ければ蛍光顕微鏡による蛍光発色の観察によっても簡便に評価できると考えている。実験結果を脱アミノ化誘起ODNの設計にフィードバックして、より有効な脱アミノ化誘起ODNの設計と合成を行う。
細胞内でBFP199C>Uの変異修復が確認されたら、同様に処理した細胞からタンパク質を抽出し、抗体を用いたウエスタンブロットや蛍光イメージアナライザーを用いた解析でGFPタンパク質の生合成と変異修復効率について確認する。
脱アミノ化誘起ODNが細胞内に導入されているにもかかわらず、BFP発現細胞を用いたin vivoのRNA修復が認められない場合は、脱アミノ化誘起ODNの細胞内での分解の可能性が考えられるため、ODNに様々な化学修飾を施す事で細胞内分解を抑制し、RNAの変異修復効率の向上を図る。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
基金分については、研究の持続的進展のため、研究期間の3年間で計画的に使用することを見込んでおり、総額380万円の約2/3を今後の使用分として残したものであり、今後の研究計画遂行のために必要不可欠なものである。
研究補助のためのリサーチアシスタント雇用に係る経費、および物品費として年次的な使用を計画している。
|
