2015 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子修復治療を目指した化学的RNA Editing法の確立
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25290072
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
塚原 俊文 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (60207339)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 仁 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 助教 (00447690)
藤本 健造 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (90293894)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 疾患治療 / 点変異 / RNA editing / 脱アミノ化 / 蛍光タンパク質 / 遺伝コード修復 / RFLP / 恒常的発現細胞株 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
機能を失った遺伝子を外来導入遺伝子によって代償するという従来の遺伝子治療に対し、本研究ではRNA editing機構を化学的に模倣して部位特異的に塩基を脱アミノ化することで遺伝コードを修復することを目指している。GFP 遺伝子の199T>C 変異体は青色蛍光を発しBFP となることに注目して、BFP-mRNAに化学的に199C>U 変異を誘起してGFP とする方法を研究した。光化学的脱アミノ化を誘起可能なCVU官能基を5’端に有するODNは37℃でも脱アミノ化の誘起が可能であった。この結果から、疾患治療用としてはCVU官能基を用いることとして以降の実験を行った。In vitro転写によって調製したBFP-mRNAとCVU含有ODNを混合後、光照射による結合、熱処理による脱アミノ化、別波長の光照射による解離による部位特異的脱アミノ化処理を行った。光化学的RNA editingは、RT-PCR-RFLPで確認しただけでなく、in vitro翻訳したタンパク質の蛍光を確認して実証した。GFPに特異的な蛍光が検出され、mRNAの一部がGFP-mRNAとなっていることが確認された。また、光化学的RNA editingした当該mRNAの全長をシークエンスし、他の箇所に変異が生じていないことを確認した。この結果は光化学的RNA editing法が疾患治療法として適用可能であることを示唆している。
より効率的な脱アミノ化を誘起するODNデザインについても検討した。ODNはBFP-mRNAに相補的な配列と、CVU官能基およびヘアピン構造で構成されるが、相補的配列長が14塩基で、ヘアピン長が9塩基のODNが12.4%と最も高い光化学的RNA editing効率を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成26年度より、研究代表者が研究科長を務めることとなり、大学の用務で多忙のため、研究に集中することが困難になった。また、研究協力者である博士後期課程学生が妊娠・出産のため、休学と研究中断を余儀なくされ、研究の遂行に遅延が生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究で、全長のBFP-mRNAを標的分子とした光化学的RNA editing（部位特異的脱アミノ化）が可能であること、さらには光化学的RNA editingを受けたmRNAから機能を有するタンパク質が合成されることが明らかとなった。これは、人為的なRNA editingによって、変異したmRNAを人為的に修復できること、即ち本法が疾患治療法として適用可能であることを示している。また、光化学的RNA editingを誘起するための合成ODNのデザインについても重要な知見が得られ、BFPをターゲットとした場合は、相補的配列長が14塩基、ヘアピン長が9塩基のODNが最も効率的であることも判明した。
一方、研究分担者である藤本はCNVK含有ODNによる光化学的RNA editingの反応機構の解明を行い、ターゲットとの塩基対形成の安定性が光化学反応に影響していることを見出し、今後の光化学的RNA editing誘起用ODN開発に重要な知見を与えた。
細胞内での光化学的RNA editingによる遺伝コード修復研究を実施するために必要なBFP遺伝子の恒常的発現細胞も、HEK293細胞株を用いて樹立しており、最終目標である細胞内での遺伝コード修復に向けて準備は整った。従って、今後はBFP発現HEK293細胞を用いた、細胞内での光化学的RNA editing研究を行う。カチオン性脂質、PEG等の他、アテロコラーゲン誘導産物などの、細胞への遺伝子導入効率が良い試薬を用いて光化学的RNA editing誘起用ODNを細胞に導入し、RNA修復を試みる。遺伝子修復の有無についてはPCR-RFLPや塩基配列決定によって確認できる。変換効率が高ければ蛍光顕微鏡による蛍光発色の観察によっても簡便に評価できる。
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| Causes of Carryover |
平成26年度より、研究代表者が研究科長を務めることとなり、大学の用務で多忙のため、研究に集中することが困難になった。また、研究協力者である博士後期課程学生が妊娠・出産により休学と研究中断を余儀なくされ、研究の遂行に遅延が生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
主にin vivo遺伝子修復実験での研究協力者の謝金としての使用を予定している。
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