2014 Fiscal Year Annual Research Report
制御RNAの機能発現とRNAシャペロンHfqの役割
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25291005
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| Research Institution | Suzuka University of Medical Science |
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Principal Investigator |
饗場 弘二 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 教授 (20025662)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 小分子RNA / Hfq / サイレンシング / 転写後制御 / 大腸菌 / 転写ターミネーター / ポリU配列 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、sRNAの機能発現におけるRNAシャペロンHfqの役割に焦点をあて、いくつかの未解明の課題に取り組むことである。平成２６年度は、平成２５年度に引き続き、sRNAのバイオジェネシスの解明とHfqの結合領域である3’末端の転写終結配列の役割を中心に研究を進めた。プラスミド上のSgrSおよびRyhB遺伝子の下流に強力なRho非依存性ターミネーターであるrrnBまたは rplLの転写終結領域を連結したダブルターミネーター系を構築し、主にノーザンブロット法により、細胞内におけるsRNA遺伝子の転写ターミネーターを読み飛ばした転写産物（リードスルー産物）を解析した。この結果、非ストレス条件ではsRNA遺伝子のリードスルーが高頻度で生じていること、すなわち、sRNA遺伝子の転写ターミネーターは比較的転写終結効率が低い特徴があることを明らかにした。転写終結産物およびリードスルー産物とHfqとの結合をin vivoおよびin vitroで解析した結果、リードスルー産物はHfqとの結合能がないことを明らかにした。このことから、ポリU配列が3’末端に位置することがsRNAの機能にとって必須であると結論した。この研究を進める目的で、合成RNA とbiotin-streptavidin 系を利用したHfqとRNAの結合をin vitro解析する方法を新たに確立し、積極的に応用した。ゲノム上のsRNA遺伝子の転写が誘導される種々のストレス条件では、sRNA遺伝子のリードスルーが顕著に抑制されること、すなわち転写終結が増強されることを見いだした。ストレス条件でのリードスルーの抑制は、ゲノム上でのSgrS遺伝子においても観察されることから、sRNA遺伝子の発現は、転写開始に加えて転写終結段階でも制御されていると結論した。sRNA生合成の調節機構の重要な新たな一面を明らかにした成果である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
原核生物のsRNAは、転写産物そのものが機能分子として働くとされているが、sRNAの3’末端の形成機構についての実験的アプローチは皆無であった。今回、sRNA遺伝子の転写終結シグナルの直後に第２の転写終結シグナルを挿入したダブルターミネーター系を構築し、sRNAのバイオジェネシスの解明に初めてメスをいれることができた。また、この系を用いた解析は、いくつかの新しい発見をもたらした。第１に、sRNA遺伝子の転写ターミネータ―では、予想以上にリードスルーが起こっていること、第２に、リードスルー産物はHfqとの結合能がないこと、したがって、ポリU配列が3’末端に位置することがsRNA機能に必要であること、第３に、biotin-streptavidin 系を利用したHfqとRNAの結合解析法を確立したこと、第４に、sRNA遺伝子の発現がストレスに応答して、転写開始段階のみならず、転写終結段階でも制御されていることを見いだしたこと、などである。
この成果は、いくつかの学会やシンポジウムで発表するとともに、すでに専門誌に投稿し、高い評価を得ており、ほぼ受理の段階に達している。したがって、本課題研究はおおむね順調に進んでいると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究から、sRNA遺伝子のRho非依存型ターミネーターは、3’末端の連続したU塩基が8つ以上あること、また、転写終結効率が非ストレス条件では弱いものの、ストレス条件では増強されるというユニークな特徴があることが明らかになった。これらの特徴はストレス条件で、機能的なsRNAの生合成にとって重要な意味を持つと考えられる。そこで、Rho非依存型ターミネーターのヘアピン構造の安定性と3’末端のポリUの形成の関係性を検証する。一般的に、ヘアピン構造の安定性が高い場合、3’末端のポリUが短いと考えられている。これらのことを踏まえれば、sRNA遺伝子のRho非依存型ターミネーターのヘアピン構造を安定化させた場合、3’末端のポリUが短くなり、sRNAとしての機能を失う可能性が考えられる。この解析は、sRNAの機能構造にさらなる理解をもたらすことに加え、転写終結メカニズムを再考する上でも有意義であると考える。また、ストレスによるsRNA遺伝子の転写終結促進の分子メカニズムの解明にもチャレンジする。ストレスによるUTPの枯渇等、具体的な作業仮説を構築し、検証を行う。Hfqの細胞内発現量の解析とHfqの自己制御機構についても研究を進める。ウエスターンブロティング法により種々の発育条件におけるHfqの発現量を定量的に解析し、Hfqの細胞内発現量を明らかにする。また、hfq 遺伝子のコピー数を増大させたときのhfq mRNAおよびHfq発現レベルをノーザンブロティング法およびウエスターンブロティング法により定量的に解析する。
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| Causes of Carryover |
研究実績の概要、及び達成度の通り、平成26年度において本計画研究はおおむね順調に進んだと考えられる。平成27年度での研究計画を、より円滑に効果的に行うために当該助成金を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当該助成金、及び翌年度分として請求した助成金は、今後の研究の推進方策にあげた計画には必要なものであり、特に当該助成金については物品消耗品費として使用を計画している。
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