2014 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質膜透過・膜挿入に必須の糖脂質酵素MPIaseの構造と機能
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25291009
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
西山 賢一 岩手大学, 農学部, 教授 (80291334)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | タンパク質膜挿入 / MPIase / SecYEG / タンパク質膜透過 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜タンパク質はその生合成に共役し多くの因子の協調的な作用により膜挿入する。我々はタンパク質膜挿入の再構成系を構築し、膜挿入に必須の因子MPIaseを同定した。MPIaseはその酵素的な作用にもかかわらず糖脂質であったことから、「糖脂質酵素（Glycolipozyme）」という概念を提唱した。MPIaseの構造を決定したところ、糖鎖部分は大腸菌外膜因子ECA(Enterobacterial Common Antigen）の糖鎖と構成成分が同じであることが判明したが、ECA生合成酵素をコードする一連のwec遺伝子群を欠失させてもMPIaseの生合成には何の影響も及ぼされなかった。そこで、MPIase生合成の遺伝子の探索を行った。MPIase生合成の最初の段階は、フォスファチジンサン（PA）にNアセチルグルコサミン（GlcNAc）が付加する反応であると予測した。PAとUDP-GlcNAcに大腸菌膜画分を作用させると、目的化合物（GlcNAc-PP-DAG）が生成することを見出し、この反応に関わる酵素を精製した。その結果、YnbBが同定された。YnbBはCdsA（CDP-DAG合成酵素）のホモログである。YnbBあるいはCdsAを過剰生産させるとGlcNAc-PP-DAG合成活性が上昇することから、これらが目的因子であると結論した。MPIaseがin vivoにおける生育およびタンパク質膜挿入に必須であることを示すため、ynbB遺伝子、cdsA遺伝子の二重破壊株を構築した。cdsA遺伝子は必須遺伝子であるため、cdsAの発現がアラビノース添加で誘導できるようにした。培地からアラビノースを除去すると生育が停止し、MPIaseの発現が激減した。このとき膜タンパク質M13 procoatの前駆体が蓄積し、MPIaseがin vivoでもタンパク質膜挿入に関与することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MPIase生合成の最初の酵素を同定し、MPIase枯渇株の構築に成功した。この株を用いて、MPIaseがin vivoでもタンパク質膜挿入に関与することを示すことができた。さらには、分泌タンパク質前駆体の蓄積も観察され、in vitro実験系で示した結果がin vivoの反応を忠実に反映することを示すことができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
MPIase生合成に関与することを明らかにしたCdsAはリン脂質生合成に関与することが知られている因子である。そのため、CdsA枯渇による生育の停止がリン脂質合成に問題が生じたためかMPIase機能が枯渇したためか結論できなかった。そのため、酵母ミトコンドリアのTam41を導入し、MPIaseが生育に必須であるかどうか調べる。Tam41はCdsAやCds1とは相同性は全くないがCdsA活性をもつことが知られている。Tam41にCDP-DAG合成活性はあるがGlcNAc-PP-DAG合成活性がなければ、MPIaseの必須性が証明できる。
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[Journal Article] Structural basis of Sec-independent membrane protein insertion by YidC2014
Author(s)
Kumazaki, K., Chiba, S., Takemoto, M., Furukawa, A., Nishiyama, K., Sugano, Y., Mori, T., Dohmae, N., Hirata, K., Nakada-Nakura, Y. Maturana, A.D., Tanaka, Y., Mori, H., Sugita, Y., Arisaka, F., Ito, K., Ishitani, R., Tsukazaki, T. and Nureki, O.
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Journal Title
Nature
Volume: 509
Pages: 516-520
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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