2014 Fiscal Year Annual Research Report
薬剤耐性緑膿菌の２つの生体膜を貫く異物排出タンパク質複合体システムの構造基盤
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25291014
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山下 栄樹 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (00294132)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中川 敦史 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (20188890)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | X線結晶構造解析 / 膜タンパク質複合体の物質輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、緑膿菌由来の異物排出タンパク質複合体システムMexAB-OprMの機能する現場で形成する構造をX線結晶構造解析で解明し、抗生物質を菌体外に放出するメカニズムを明らかにする。本年度はMexAB-OprM複合体システムの化学量比について調べる。そのために、以下のことを実施した。
I. MexAB-OprM複合体システムの長期安定に保つための条件検討
複合体が構造解析に耐えうる結晶に成長するためには、複合体が均質な構造を保ち長期（最低１週間）にわたって安定である必要がある。そのため、塩の種類や濃度、界面活性剤の種類を変え、約80条件について、動的光散乱法や電子顕微鏡を用いて長期の構造安定性について調べた。その結果、低塩濃度の条件が比較的長期に構造上安定であることを示した。また、複合体が長期安定な条件下でゲル濾過を行い、得られた複合体画分をSDS電気泳動法によって、各構成タンパク質の量比を確認できた。
II. 結晶化条件の探索
動的光散乱法や電子顕微鏡を用いて得られた長期に複合体を安定に保つ条件は低塩濃度の条件であったので、様々な長さのPEGを沈殿剤とし、数100種類にもおよぶ結晶化条件の探索を行ったが、結晶は得られていない。結晶化条件の多くの条件で沈殿も観察出来ていないことから、結晶化に用いる複合体の濃度が低い可能性が考えられる。複合体の濃度が低く結晶化に用いることができなかった試料を、電子顕微鏡を用いた低分解能での構造解析用試料として利用した。複合体試料をモリブデン染色し、電子顕微鏡像を撮影した。その中から特徴的な複合体の単粒子像約3000枚を収集することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
動的光散乱法や電子顕微鏡を用いて、2つの生体膜を貫く異物排出タンパク質複合体システムが安定に長期（最低１週間）にわたって均質な構造を保つ条件を見つけることに成功した。得られた条件を元に、ゲル濾過を用いて複合体試料を再調整し、高純度の複合体を得ることに成功した。高純度の複合体試料をSDS電気泳動法により各構成タンパク質の量比を解析したところ、MexA:B:OprMが2:1:1であることが示唆できた。
高純度の複合体試料は得られているが、さらなる結晶化条件探索を行うために絶対量を増やす必要があり、そのための培養および精製方法を確立しつつある。結晶化条件探索を行いつつ、複合体の濃度が低い試料から電子顕微鏡を用いた構造解析に向けた像の収集に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
MexAB-OprM複合体システムの構造解析に向けて以下の今後以下の方策で行う。
I. 結晶化条件の探索：高濃度の複合体試料を用いて結晶化を行う。界面活性剤を用いた結晶化で出なければ、リン脂質を利用した結晶化を検討する。
II. 結晶構造解析：SPring-8のビームラインBL44XUで回折強度データを収集し、MexAB-OprM複合体システムの立体構造を明らかにする。
III.2層の膜を介した菌体外への異物排出機構の解明:各構成分子間の相互作用を調べ、アダプター分子MexAによる内膜トランスポーターMexBおよび外膜チャンネルタンパク質OprMとの連結機構を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
計画申請時は、異物排出タンパク質複合体システムを構成する2種類の膜タンパク質(MexB, OprM)をタイミング良く精製するための超遠心機を設備備品として考えていたが、昨年度導入したオートサンプラーを用いた多種検討を短期間に行うことによって、それぞれの膜タンパク質の精製方法を改善することに成功した。これにより、人海戦術により現有の超遠心機で2種類の膜タンパク質をタイミング良く精製することが可能となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現有の超遠心機で2種類の膜タンパク質をタイミング良く精製することが可能となったが、2種類の膜タンパク質を安定に精製できる界面活性剤が高価なため消耗品費用が嵩む。複合体の結晶化には、微量で結晶化が可能な既存の結晶化システムを利用する予定だが、結晶化システム専用の消耗品が必要であり、また、結晶化試料観察に新型の電子顕微鏡用カメラを利用するための消耗品等が発生するので、当初予定より消耗品費が多くなることが予想される。構成する3種類のタンパク質を同時に大量に精製するためには、精製過程の初期に人手が必要となるので、アルバイトを含む人件費として使用予定である。
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