2015 Fiscal Year Annual Research Report
受精に関与する精子細胞外ユビキチン-プロテアソーム系に関する研究
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25291024
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
澤田 均 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (60158946)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 受精 / 精子 / ユビキチン / プロテアソーム / ライシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）マボヤに関する研究：(i) マボヤゲノムデータベースを構築し公開した。(ii) ユビキチンｰプロテアソーム系 (UPS) の活性化に関わりうる精子トリプシン様酵素HrProacrosinのcDNAクローニングを再検討したところ、既報の配列に誤読があり、実際には3個のトリプシン様プロテアーゼドメインが合計6個のCUBドメインによって分断され直列に連結したポリプロテアーゼHrOvochymaseとして精子や濾胞細胞に存在することが明らかとなった。この酵素が卵成熟時の自家不和合性獲得、受精時のライシン、さらに受精時の精子プロテアソームの活性化に関わる可能性が考えられ、今後の検討課題である。
（２）カタユウレイボヤに関する研究：(i) インタクト精子と先体反応後の精子の細胞表面に存在するタンパク質を質量分析により網羅的に解析した。しかし、検討した条件では、UPS関連のタンパク質は検出できなかった。その一方で、プロテアソームに加えて金属プロテアーゼであるアスタシン様プロテアーゼもライシンとして機能する可能性が示された。この酵素に対する阻害剤は、精子の卵黄膜への結合から通過に至る過程に関わることが示された。現在この酵素の遺伝子破壊を行っており、その機能を明確に証明することを企画している。(ii)市販のプロテアソーム抗体を用いて免疫染色を行ったが、精子を細胞膜透過性処理を行った場合のみ精子頭部と尾部が染色される結果を得た。今回の方法では、先体反応前後における精子細胞膜表面のプロテアソームの存在を確認することはできなかったが、今後さらに感度を上げて検討する必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、マボヤの精子プロテアソームとユビキチン化酵素の大量精製を計画していたが、女川湾で養殖されているマボヤが被嚢軟化症に罹患している可能性があり、東北大学浅虫海洋生物学センターに輸送して飼育することができなくなったた。そのため、配偶子の大量調製が困難となり、当初計画が遅延している。来年度は浅虫産のマボヤが生殖可能な成体に成育するので、地元漁師から購入して当初の計画を実行する予定である。精巣特異的に発現するプロテアソームアクティベーターPA200の機能に興味を持ち、その遺伝子破壊を計画していたが、マウスで同じ実験が日本の他研究室で行われ最近発表された。マウスではPA200とPA28γのdKOにしないと不稔にならないと報告された。今後、ホヤからもこの遺伝子をクローニングし、遺伝子破壊による機能解析を行いたい。PA200にはプロテアソームを細胞外に輸送したり精子膜にアンカリングさせる機構があるのではないかと考えており、その相互作用タンパク質も探る。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）マボヤのHrVC70をユビキチン化する酵素を探索する。特に、遺伝子的にHrVC120に近接するE3と精子･精巣特異的E1に着目する。最近その候補分子が発見されたので、クローニングを行う。（２）マボヤのHrOvochymaseの生理的基質を探索する。（３）最近、プロテアソームアクティベーターPA200とPA28γのdKOマウスの精子は不稔になると報告されているので、マボヤ精子PA200のcDNAクローニングと機能解析する。（４）精子ユビキチン化酵素とプロテアソームの抗体を用いて、細胞外に局在する酵素を同定する。プロテオーム解析も感度を上げて行う。（５）PA200やPA28γと相互作用する精子タンパク質を探索し、精子細胞表面へのアンカリングや細胞外輸送に関わる可能性について検討する。
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| Causes of Carryover |
本研究は、マボヤ精子からユビキチンプロテアソーム系 (UPS) を構成する酵素群を精製し、その構造と機能を探ることを目的としている。今迄、マボヤ養殖場のある女川から東北大学浅虫海洋生物センターに養殖マボヤを輸送して実験していたが、女川のマボヤは被嚢軟化症に感染している可能性があり浅虫の漁師が輸送に反対している。そのため、マボヤの入手が困難となり、酵素の精製に予定以上に時間を要した。来年度は浅虫産マボヤが入手可能となるので、当初の研究目的を達成し研究成果をまとめる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
生殖可能なマボヤを浅虫の漁師から大量に購入し、浅虫海洋生物センターで保管飼育しつつ、毎日70匹前後さばいて精子と卵を採取する。得られた精子と卵は凍結保存し、そこから酵素の精製を行う。精製酵素の構造解析を行い、抗体を作製する。その抗体を用いて精子におけるUPSの局在性解析と機能解析を行う。また、これに並行して、プロテアソームアクティベーターPA200のcDNAクローニングと局在性、ならびにその相互作用タンパク質の解析を行う。これらの実験から精子UPSの細胞膜アンカリング機構や細胞外輸送機構に関する手がかりを得る。
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Research Products
(18 results)
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[Journal Article] ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians.2016
Author(s)
Brozovic M, Martin C, Dantec C, Dauga D, Mendez M, Simion P, Percher M, Laporte B, Scornavacca C, Di Gregorio A, Fujiwara S, Gineste M, Lowe EK, Piette J, Racioppi C, Ristoratore F, Sasakura Y, Takatori N, Brown TC, Delsuc F, Douzery E, Gissi C, McDougall A, Nishida H, Sawada H, Swalla BJ, Yasuo H, and Lemaire P.
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Journal Title
Nucleic Acids Research
Volume: 44
Pages: D808-D818
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Transcriptional framework of male gametogenesis in the liverwort Marchantia polymorpha L2016
Author(s)
Higo A., Niwa, M., Yamato, K.T., Yamada L., Sawada H., Sakamoto, T., Kurata T., Shiyawaka, M., Endo M., Shigenobu, S., Yamaguchi, K., Ishizaki, K., Nishihama, R., Korchi T., and Araki, T.
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Journal Title
Plant Cell Physiology
Volume: 57
Pages: 325-338
DOI
Peer Reviewed
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