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2013 Fiscal Year Annual Research Report

ゲノムDNAのメチル化模様維持機構に関する研究

Research Project

Project/Area Number 25291025
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

田嶋 正二  大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (50132931)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 末武 勲  大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (80304054)
Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
KeywordsDNAメチル化 / DNAメチル化酵素 / DNAメチル化模様維持
Research Abstract

脊椎動物ゲノムのCpG配列中のシトシン塩基は、しばしばメチル化修飾を受けている。シトシン塩基のメチル化は、遺伝情報発現に抑制的に働く“エピジェネティクス”要因の一つであり、DNAのメチル化による遺伝情報制御は発生・分化に欠くことができない重要な役割を果たしている。メチル化模様は複製の過程で次世代の細胞に正確に伝えられる。この世代を超えたメチル化模様の伝達にはDnmt1と呼ばれるDNAメチル化酵素の一つが責任酵素として働いている。本研究計画ではDnmt1について、へミメチル化(片鎖だけがメチル化された)DNAを認識する機構と、生体内でメチル化模様の維持に必須な因子であるNp95(別名Uhrf1)との共役について、構造生物学的、生化学的にするが、本年度はNp95とDnmt1が直接、あるいは間接的に相互作用して維持メチル化活性に寄与することを明らかにした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成25年度は、Dnmt1のDNA維持メチル化機構を試験管内で解析し、Np95/Uhrf1の中のヘミメチルDNAに結合するSRA領域がDnmt1の複製フォーク標的化シグナル(RFTS)領域と直接相互作用し、Dnmt1の触媒領域を覆っているRFTSを除去して、DNAが触媒中心にアクセスしやすくさせていることを明らかにした。また、RFTS領域と触媒領域の水素結合に関わるアミノ酸残基に変異を入れた組換えDnmt1のDNAメチル化活性を測定し、この水素結合がRFTSを触媒ポケットに繋ぎとめるうえで重要であることを示した。さらに、ヘミメチルDNAに結合したSRA領域はRFTSと相互作用することでDNAを遊離することを明らかにした。以上の成果を論文として発表した。
また、ゲノムのメチルシトシンはヒドロキシル化修飾を受けることにより、脱メチル化の印となっていることが知られている。胚性幹細胞ではヒドロキシルメチルシトシン含量が一般の体細胞に比べて高いが、これは新規メチル化修飾酵素Dnmt3aとDnmt3bによりメチル化されたシトシンが選択的に標的となってヒドロキシル化修飾を受けていることによる。このヒドロキシル化されたシトシンは、複製過程でDnmt1により維持されないことにより消去される。胚性幹細胞内でDnmt3aとDnmt3bによりメチル化されるシトシンは積極的にヒドロキシメチル化されることにより、複製を介してDnmt1による受身な脱メチル化により、ダイナミックに調節されていることを明らかにした。成果を論文として発表した。

Strategy for Future Research Activity

今年度はRFTS領域が細胞内で維持メチル化にどのように寄与しているのかについて、Dnmt1をN末端側から順次欠失させ、内在的なDnmt1を薬剤で欠失させることができるように細工した胚性幹細胞に発現させ、N末端の領域、特にRFTSの維持メチル化に果たす役割を明らかにする。すでに、N末欠失型とRFTSと触媒領域の水素結合に関わるアミノ酸残基に変異を入れたDnmt1をES細胞に発現させたクローンの解析を進めており、今年度中に再現性をとり論文投稿する予定である。また、変異型組換えDnmt1とUhrf1を用いた試験管内での解析については、RFTSとSRA領域に部位特異的な点変異を導入して、相互作用するアミノ酸残基を同定する。これにより、複製フォークに存在するNp95/Uhrf1からDnmt1がどのようにしてヘミメチルDNAを受とっているのかについて理解する。また、試験管内では、Dnmt1はヘミメチル化DNAを高い信頼度(fidelity)で維持メチル化できないが、細胞内では複製過程で非常に高い信頼度でメチル化模様は維持されている。Np95/Uhrf1を共存させることにより維持メチル化活性の信頼度が上昇する可能性を検証する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

実験が予想以上にうまく進み、経費に無駄がなく研究を進めることができたため。
特に特別の出費の予定はなく、計画通りの支出が見込まれるが、今年度は人員を昨年度以上にかけて計画を進める予定であるので、物品費が昨年度以上に嵩むことが予想される。

  • Research Products

    (9 results)

All 2014 2013

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (5 results) Book (2 results)

  • [Journal Article] The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA2014

    • Author(s)
      Ahmet Can Berkyurek, Isao Suetake, Kyohei Arita, Kohei Takeshita, Atsushi Nakagawa, Masahiro Shirakawa, and Shoji Tajima
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 289 Pages: 379-386

    • DOI

      10.1074/jbc.M113.523209

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Cell cycle-dependent turnover of 5-hydroxymethyl cytosine in mouse embryonic stem cells2013

    • Author(s)
      Junji Otani, Hironobu Kimura, Jafar Sharif, Takaho A. Endo, Yuichi Mishima, Toru Kawakami, Haruhiko Koseki, Masahiro Shirakawa, Isao Suetake, and Shoji Tajima
    • Journal Title

      PLoS ONE

      Volume: 8 Pages: e82961

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0082961. eCollection 2013

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Relative positions of 5-hydroxymethylcytosine and 5-methylcytosine at promoter correlates with the level of gene expression2013

    • Author(s)
      Hironobu Kimura, Norie Tooi, Toru Kawakami, Tatsuhiro Thomoto, Kazuhiro Aiba, Isao Suetake, Norio Nakatsuji and Shoji Tajima
    • Organizer
      International Symposium on Transcription and Metabolism
    • Place of Presentation
      Awaji Yumebutai International Conference Center, Hyogo, Japan
    • Year and Date
      20131111-20131113
  • [Presentation] DNA鎖長とNp95のSRA領域はDnmt1のRFTSを触媒ポケットから除去するステップに寄与する2013

    • Author(s)
      アーメット・キャン・ベルキュレック、有田 恭平、竹下 浩平、中川 敦史、白川 昌宏、末武 勲、田嶋 正二
    • Organizer
      第7回日本エピジェネティクス研究会年会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂
    • Year and Date
      20130530-20130531
  • [Presentation] Dnmt1のRFTSと触媒領域間の水素結合のDNAメチル化に果たす役割2013

    • Author(s)
      ロナルド G. ガルビレス、長谷川貴志、木村博信、ジャファル シャリフ、古関明彦、末武勲、田嶋正二
    • Organizer
      第7回日本エピジェネティクス研究会年会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂
    • Year and Date
      20130530-20130531
  • [Presentation] マウスES細胞におけるヒドロキシメチルシトシンの産生と消去2013

    • Author(s)
      木村博信、大谷淳二、川上 徹、白川昌宏、末武 勲、田嶋正二
    • Organizer
      第7回日本エピジェネティクス研究会年会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂
    • Year and Date
      20130530-20130531
  • [Presentation] ヘミメチル化DNAによるヌクレオソーム再構成とDnmt1によるメチル化2013

    • Author(s)
      岡 翔太、ラウラ ブルックナー、三島優一、末武勲、田嶋正二
    • Organizer
      第7回日本エピジェネティクス研究会年会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂
    • Year and Date
      20130530-20130531
  • [Book] エピジェネティクスキーワード事典-分子機構から疾患・解析技術まで-(牛島俊和、眞貝洋一編集)2013

    • Author(s)
      木村博信、田嶋正二
    • Total Pages
      pp 20-25
    • Publisher
      羊土社
  • [Book] エピジェネティクス-その分子機構から高次生命機能まで-(田嶋正二編集)2013

    • Author(s)
      田嶋正二
    • Total Pages
      pp 3-20
    • Publisher
      化学同人

URL: 

Published: 2015-05-28  

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