2014 Fiscal Year Annual Research Report
多機能増殖制御因子／新規ヒストンシャペロンGRWD1の新規機能解明
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25291027
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
藤田 雅俊 九州大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (30270713)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | GRWD1 / ヒストンシャペロン / Pura / 転写 / EDDユビキチンリガーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明
これまでの結果から、GRWD1がp53と共にp53反応性プロモーター部位に結合し、その転写活性化能を抑制制御している可能性が示唆された。そこで、ChIPによりこの仮説の検証を試みたが、GRWD1抗体のロットの違いでChIPがうまく働かないトラブルがあり結果を得られなかった。この問題が最近解決したので、今後この点を明らかにして行きたい。加えて本年度は、① GRWD1の過剰発現が細胞においてp53応答経路を抑制することが明らかとなった。これは、p53の転写能抑制に加えて、下述する核小体ストレス応答経路の抑制の結果だと現在考えている。さらに、② GRWD1とHPV E7の発現により、ヒト正常線維芽細胞が足場非依存性増殖能を獲得することが明らかとなった。GRWD1が各種がん細胞株で過剰発現していることも併せ、GRWD1は新規のがん遺伝子であると考えている。
（２）ユビキチンリガーゼEDDの機能・制御へのGRWD1の関与の解明
EDDはDDB1及びVprBPと共にEDVP E3ユビキチンリガーゼ複合体を形成している。また、RPL23はMDM2ユビキチンリガーゼに結合しその活性を抑制することでp53を誘導し、核小体ストレス応答を引き起こす。そこで、EDD-DDB1-GRWD1がユビキチンリガーゼとしてRPL23の量的制御を行っている可能性を考えた。GRWD1の過剰発現によりRPL23タンパク質量が減少し、これはMG132添加により抑制された。次にsiRNAを用いてGRWD1を発現抑制した後、核小体ストレスを誘導したところ、RPL23量の増加が見られた。さらに、EDDの過剰発現でもRPL23量が減少し、GRWD1およびEDDの共発現で相乗的なRPL23量の減少が見られた。また、DDB1の過剰発現によってもRPL23量は減少した。加えてRPL23が細胞内でユビキチン化を受けており、それはGRWD1およびEDDの過剰発現で増加することも判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
全体的に、概ね順調に進んでいると考えている。まず、「転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明」については、上述のようにp53の転写能に対してGRWD1が抑制的に働き得るという極めて興味深い結果を得ており、さらに研究を進めている。次に、「ユビキチンリガーゼEDDの機能・制御へのGRWD1の関与の解明」についてであるが、まずGRWD1抑制によりEDD量が増加することが判明した。しかし、当初予想していたEDDのユビキチン化を介した分解制御にGRWD1が関与していると言う仮説は否定された。一方で、上述したように、GRWD1がEDD-DDB1ユビキチンリガーゼ複合体とRPL23をつなぐアダプターとして機能することで、ユビキチン-プロテアソーム系を介したRPL23タンパク質分解を促進しているという、新たな興味深い所見が得られつつある。これら二つの新たなGRWD1の機能は、いずれもp53機能の抑制に結びつく。その結果として、GRWD1の過剰発現によるp53応答経路の抑制とがん化能促進が起こると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明
上記の結果を踏まえ、今年度は、以下の検討を行う。① 当該プロモーターへのGRWD1、Puraの結合をChIP法で調べる。また、その結合へのp53の関与を調べる。逆に、p53結合にGRWD1やPuraの過剰発現が影響を与えていないか調べる。② 転写抑制能へのGRWD1酸性ドメインの寄与を調べる。③ 併せて、当該領域opennessへのGRWD1、Puraの影響をFAIRE-qPCRやヒストンChIP-qPCR法で調べる。④ p53、GRWD1、Pura間の物理的相互作用を減弱させるそれぞれの変異の同定を試み、それらの当該反応への影響を調べる。⑤ 可能ならば、PuraのChIP-Seqも行い、p53やGRWD1のデータと比較検討したい。
（２）GRWD1とEDDの核小体機能制御への関与の検討
上記のように、GRWD1はRPL23のユビキチン／プロテアソーム系を介した分解を促進的に制御している可能性が示されつつある。今年度は以下の検討を行う。①現時点で有力な仮説は、EDD-DDB1-GRWD1がRPL23ユビキチンリガーゼとして働いていると言うものである。そこで、過剰発現とsiRNAによる抑制を組み合わせ、細胞でのRPL23のユビキチン化や分解を指標に、この仮説の妥当性を検証する。②併せて、細胞からEDD-DDB1-GRWD1ユビキチンリガーゼを精製し、試験管内でRPL23をユビキチン化できるのかを明らかにする。③ Cul4-DDB1-GRWD1がRPL23ユビキチンリガーゼとして働いているという可能性をまだ排除できていない。この点についても検討を進める。
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| Causes of Carryover |
上述したように、GRWD1のp53反応性プロモーターにおけるChIP解析でのトラブルなど、一部の研究が多少遅れている部分がある。そのため、その後の解析の一部が平成27年度にずれ込んだ。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
これについては、上述した今後の研究方針に従い、平成27年度の研究費と併せ、研究の邁進のために適切に執行して行きたい。
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