2013 Fiscal Year Annual Research Report
酸素分子が制御する細胞内タンパク質への銅イオン供給メカニズム
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25291028
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
古川 良明 慶應義塾大学, 理工学部, 准教授 (40415287)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 銅イオン / 金属シャペロン / ジスルフィド結合 |
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| Research Abstract |
銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）は、銅・亜鉛イオンを結合し、分子内にジスルフィド（S-S）結合を形成することで活性化する抗酸化酵素である。ほぼ全ての好気性生物はSODを有しており、活性中心として機能する銅イオンの結合部位に加えて、分子内S-S結合が高度に保存されている。そこで、大腸菌のSODCに着目し、SODCの構造・機能に分子内S-S結合が果たす役割について検討を行った。
まず、S-S結合を有したSODC（SODCS-S）、及び、S-S結合形成に関わる二つのCys（Cys50, Cys144）をAlaに置換したS-S結合切断型のSODC（SODCDM）を作製し、S-S結合形成がSOD活性に及ぼす影響を検討した。その結果、活性中心である銅イオンをSODCS-Sに加えるとSOD活性が確認されるのに対して、S-S結合がなければ（SODCDM）、銅イオンを添加しても活性化しなかった。そこで、SODCS-S及びSODCDMにおける銅・亜鉛イオンを定量したところ、どちらの金属イオンについても、SODCS-Sには結合するものの、S-S結合のないSODCDMにはほとんど結合していないことが分かった。これらの結果は、SODCが銅・亜鉛イオンを結合して酵素として活性化するためには、S-S結合の形成が必須であることを示している。さらに、S-S結合の形成に伴って、ランダムコイル様のSODCにβ－シート構造が形成することが円二色性分光法、及びフーリエ変換赤外分光法により明らかとなった。
以上の結果から、大腸菌内では、SODCの立体構造形成（フォールディング）がS-S結合の導入によって進行した後に、銅・亜鉛イオンが結合することでSODCが活性化すると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、細胞内における銅イオン輸送の制御メカニズムを明らかにすることである。現在までに、銅イオン結合タンパク質であるSOD1/SODCの作製法を確立し、その銅イオン結合プロセスについて生化学的・分光学的なキャラクタリゼーションを進めることができた。特に、大腸菌におけるSODCの銅イオン獲得メカニズムについてはこれまでに明らかでなかったものの、本研究により、その制御因子として、ジスルフィド結合形成を提案することができ、現在論文として投稿中である。また、SOD1に対する銅シャペロンであるCCSについても、その精製方法の確立を進めており、その銅イオン結合特性を評価しているところである。よって、本研究は概ね順調に進められていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２５年度で得られた成果、及び、これまでの研究成果をさらに発展させ、SOD1が銅イオンを結合し酵素として活性化するには、酸素分子が必要であることを検証する。各々の銅タンパク質が呈する酵素活性の測定手法は既報に従い、発現量についてはウェスタンブロッティングにより確認する。酵素としての活性を呈さないものについても、免疫沈降法により精製した後にICP-MSで分析する手法を確立し、タンパク質に結合している銅イオン量を直接定量することを試みる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
酸素分子の影響を検討するために必要となるグローブボックス、及び、大腸菌培養のためのインキュベーターシェーカーについて、より性能の良いものを選定・購入するために時間が必要となったため、本年度ではなく次年度での購入とした。なお、これらの研究機器を次年度に購入し、速やかに実験・研究を遂行することで、本課題の遂行には大きな影響は生じない。
インキュベーターシェーカーなどの設備備品の購入に充て、速やかに本課題に記載の実験・研究を遂行する予定である。
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