2013 Fiscal Year Annual Research Report
多段階プロセスとしての胎児型赤芽球の循環開始機構の解明
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25291051
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
瀬原 淳子 京都大学, 再生医科学研究所, 教授 (60209038)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ADAMプロテアーゼ / 血管形成 / 血液循環 / 造血 / ゼブラフィッシュ / ライブイメージング |
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| Research Abstract |
脊椎動物発生過程において最初の造血の場（ほ乳類では卵黄嚢壁の血島）では主に胎児型赤血球が産生されるが、意外にも、そこで産生される赤血球がどのように循環し始めるのか、その制御機構は殆ど解明されていなかった。我々はゼブラフィッシュ胚のライブイメージングにより、胎児型赤血球の循環開始が循環系内で働くメタロプロテアーゼ活性に依存すること、血球で高発現する膜型メタロプロテアーゼADAM8を必要とすることを発見した。本研究はその発見を発展させ、血液循環開始機構をADAM8 を中心とする血球・血管の相互作用・接着制御の観点から解明し、能動的プロセスとしての循環開始機構の解明をめざしてきた。その結果、 ADAM8に依存する血液循環の開始がないと、血管におけるNotchシグナルに異常が生じ、NotchのリガンドであるDll4・ Notchの下流ではたらく hey2の発現上昇がみられること、それは、ADAM8のドミナントネガティブフォームを血球で発現しても同様に見られることから、血球の血管への接着が、血管の分化を妨げて、その結果、節間動脈の形成が妨げられることがわかった。また、ADAM10という他のプロテアーゼのノックダウンでは、さらに早期に血管形成が妨げられること、血球で発現するインテグリンや細胞外基質の変異体においても、血管形成初期でその制御をおこなっていることを見いだした。
一方、ホ乳類におけるADAM8の役割を探るため、ADAM8ノックアウトマウスの解析も行っている。ADAM8ノックアウトマウスは、赤血球の循環にしては異常がなかった。そこで、ADAM8を強く発現する炎症性の細胞である好中球・マクロファージに着目し、これらの細胞の挙動をADAM8が制御している可能性を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
血球がいかに血管形成を制御するか、については、近年、マクロファージや血小板などが、血管のリモデリングに関与することが報告され、注目を浴びている。しかし、発生の過程で、血球が血管形成を何らかの形で制御しているのかどうかは、殆どわかっていない。それに対して、我々は本研究において、血球で発現する ADAM８が節間血管形成を促すことにはじまり、ADAM10やインテグリン、細胞外基質の関与を明らかにすることによって、確かに、血球がそれらの因子の働きを介して血管形成に関与していることを示した。その意味で、この研究は研究計画に沿って、概ね順調に進展したと言える。
さらに、ADAM8に関してはマウスの ADAM8の役割・機能に関しても研究を進め、筋再生に先行する筋の炎症反応において、ADAM8が必要であることを示した。筋再生において、ADAM8は筋損傷後１日目に、好中球・単球を中心とする血球系で強く発現することがわかった。ADAM8ノックアウトマウスでは、好中球や単球は、再生部位に概ね到達し、筋再生も起こるが、損傷を受け壊死を起こした骨格筋がこれらの炎症細胞によって除去される活性が不完全であることを見いだした。マウスを用いた研究に関しても、その進展は良好であると言えるだろう。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、本研究の過程でわかってきたことは、何よりも、本来の血管形成がどのように行われるのか、細胞レベレルできちんとわかっていない、ということであった。大動脈がどのようにできるのか、主静脈がどのようにできるのか、その際、赤芽球やマクロファージはどこでどのように産生され、そのあとどのように挙動するのか、などの問題である。おそらく、これをきちんと解明できるのは、ゼブラフィッシュやメダカのような小型魚類の胚であるに違いない。その上で、先に述べた、ADAM8やADAM10、インテグリンや細胞外基質の位置づけが明らかにされるべきである。
昨年度はそのような理由から、予想外に多くの時間を二光子顕微鏡のセットアップ・観察条件の検討などに費やすこととなり、どのように血管形成を観察すべきかを検討してきた。二光子顕微鏡を用いることによって、これまで利用してきた共焦点顕微鏡よりも、胚のより深部まで明瞭に観察することができることがわかったからである。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
２００万円を繰越したのは、ようやくセットアップできた二光子顕微鏡を用いて、上記の疑問に答えるべく初期血管形成・血球産生の道筋を詳しく観察するという新たに必要となった実験の遂行に対応するためである。そして、そこで得られる知識をもとに、ADAMプロテアーゼヤインテグリン・細胞外基質の働きなどを検討するためである。
本年度は、この二光子顕微鏡の利用に合わせて準備してきた、新たな血管観察のためのトランスジェニックラインや、血球可視化のトランスジェニックラインを用いて、上記に述べた、本来の血管形成・血球再生の問題、すなわち、大動脈がどのようにできるのか、主静脈がどのようにできるのか、その際、赤芽球やマクロファージはどこでどのように産生され、そのあとどのように挙動するのか、を観察し、細胞学的な性質を調べる。そしてその中で、ADAMプロテアーゼヤインテグリン・細胞外基質の働きを明らかにする予定である。
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