2014 Fiscal Year Annual Research Report
植物オルガネラ遺伝子の発現を統御する核コードPPRタンパク質の機能解析
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25291059
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
杉田 護 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 教授 (70154474)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 葉緑体 / ミトコンドリア / 遺伝子発現 / PPRタンパク質 / RNA編集 / RNAスプライシング / RNase P / DYWドメイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
葉緑体とミトコンドリアの遺伝子発現をコントロールする核ゲノムの発現ネットワークについては未だ不明な点が多い。近年、オルガネラ遺伝子の発現制御の鍵因子としてpentatricopeptide repeat (PPR)タンパク質が注目されているがその機能に関する知見は断片的にすぎない。本研究ではPPRタンパク質を網羅的に解析して、PPRタンパクによる植物オルガネラ遺伝子の発現制御の分子機構解明を目指す。２６年度に得られた成果は以下の通りである。
(1) V3.1に更新されたヒメツリガネゴケのゲノムデータベースを用いて、細胞内局在が不明であった８種のPPRタンパク質について細胞内局在予測を行った。その結果、６種については細胞内局在が葉緑体またはミトコンドリアと推定された。
(2)メタロヌクレアーゼドメインをもつ３種類のPタイプPPRタンパク質の機能解析を行った。その結果、３種ともpre-tRNAの5’リーダー配列を切断するRNaseP活性をもつことを生化学的に明らかにした。２種（PpPPR_67とPpPPR_104）は葉緑体とミトコンドリアで、１種（PpPPR_63）は核内でそれぞれ特定のtRNA分子種の成熟過程に関与している可能性を見出した。この成果をPLoS ONE誌に論文発表した。
(3)DYWドメインをもつPpPPR_45が葉緑体rps14 mRNAのRNA編集因子であることを、PpPPR_45遺伝子の発現抑制株および過剰発現株を用いた解析により初めて明らかにした。この成果をFEBS Letters誌に論文発表した。
(4)ヒメツリガネゴケのPタイプPPRタンパク質の機能解明を目指して、19種のPPR遺伝子ノックアウト(KO)株の作製を試みた。その結果、7種のKO株取得に成功した。このうち顕著な生育遅延を示したPpPPR_4 KO株について詳細な解析を行った。その結果、PpPPR_4が葉緑体の複数種のmRNAとtRNAのスプライシングに関与している可能性が高いことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)計10種のPタイプPPRタンパク質遺伝子KO株の取得に成功し、このうち4種のPPRタンパク質については機能解析を行い一定の成果を得た（Sugita et al. PLoS ONE 2014）。
(2)KO株の取得が困難であったPpPPR_45遺伝子について、遺伝子発現抑制株と過剰発現株を取得し解析した。その結果、PpPPR_45が葉緑体のrps14 mRNAのRNA編集に関与する因子であることを明らかにし、論文発表した（Ichinose et al. FEBS Lett. 2014）。
(3)RNA編集におけるDYWドメインの役割に関して一定の成果が得られた（論文準備中）。
以上のように、研究はほぼ予定通り順調に進展し、成果の一部を論文として公表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)残り２種のPPRタンパク質の細胞内局在が不明である。27年度中に細胞内局在を決定する。
(2)できるだけ多くのPPRタンパク質の標的RNAを同定し作用機作を解明することに重点をおく。そのためPPR遺伝子のノックアウト（KO）株と発現抑制（KD）株を用いて、葉緑体とミトコンドリアのRNA蓄積レベルとパターンの異常を検出する。これをRNA-Seq法を用いて行う。
(3)PPRタンパク質の機能ドメインの解析をさらに進める。シチジンデアミナーゼ活性とRNA編集部位認識の特異性を決定するアミノ酸殘基またはアミノ酸領域を同定する。このための材料としてRNA編集欠損変異株を用いたRNA編集相補実験を網羅的に行う。
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| Causes of Carryover |
実験が順調に進展した結果、物品費の支出が予定よりも小額で済んだため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
物品費としてDNAとRNAの解析に必要な分子生物学試薬とプラスチック器具、およびシーケンス分析委託経費等に200万円、研究成果発表のための国内旅費（10万円）と外国旅費（30万円）を使用予定である。変異株の作製と育成のための実験補助として人件費、英文校閲と論文掲載の費用に110万円を使用する予定である。
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Research Products
(16 results)
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[Journal Article] Molecular characterization of three PRORP proteins in the moss Physcomitrella patens: nuclear PRORP protein is not essential for moss viability.2014
Author(s)
Sugita, C., Komura, Y., Tanaka, K., Kometani, K., Satoh, H. and Sugita, M.
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Journal Title
PLoS ONE
Volume: 9
Pages: e108962
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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