2013 Fiscal Year Annual Research Report
エピジェネティックな遺伝子発現制御を介した分子育種法の開発
| Project/Area Number |
25292002
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
金澤 章 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (30281794)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 遺伝子発現制御 / エピジェネティクス / シトシンメチル化 / RNAサイレンシング / RNA機能 |
|---|
| Research Abstract |
本研究の開始時点において、研究代表者は新規なウイルスベクターを用いて、二本鎖RNAの機能により、植物の遺伝子のプロモーターに塩基配列特異的にDNAメチル化を誘導し、それを介した遺伝子の転写抑制を誘導することに成功していた。本研究では、エピジェネティックな遺伝子発現制御を利用した植物の育種を確立する目的から、このRNA-directed DNA methylaion (RdDM) 系を用いて、エピジェネティックな変化の誘導に影響する要因を解析した。シロイヌナズナではDNA脱メチル化に関与するタンパク質ROS1の存在が知られている。本研究では、ウイルスベクターを用いた解析に適した植物であるNicotiana benthamiana を用い、RNA機能を利用した遺伝子特異的なエピジェネティックな変化の誘導効率がROS1遺伝子のオーソログの発現量の違いによって影響を受けるか否か、検討した。第一に、N. benthamianaにおけるROS1遺伝子のオーソログを単離した。一方、レポーター遺伝子を導入してあるN. benthamiana 植物体に対し、このレポーター遺伝子の転写を制御しているCaMV 35Sプロモーターの部分配列を挿入したウイルスを感染させると、このプロモーターのシトシンのメチル化が誘導された。CaMV 35Sプロモーターの部分配列を挿入したウイルスを感染させる際、同時にROS1遺伝子のオーソログの部分配列を挿入したウイルスを同時に感染させた。その結果、ROS1遺伝子のオーソログのRNA分解が誘導され、そのmRNA量が顕著に減少し、それとともにCaMV 35Sプロモーターのメチル化頻度が増加した。これらのことから、ROS1遺伝子のオーソログのノックダウンを同時に誘導することが、RdDMにおいて標的とするDNA領域のメチル化を増加させるために有効であることが明らかになった。これらのことに加え、単一のベクターでROS1遺伝子のオーソログのノックダウンとRdDMを誘導することを検討するとともに、他の遺伝子の発現への影響を解析した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
研究を実施した結果、研究実績の概要において記述したとおり、ROS1遺伝子のオーソログのノックダウンを行うことにより、RdDMによる標的DNAのメチル化を増強できることが示された。すなわち、エピジェネティックな変化の誘導に影響する要因としてROS1遺伝子のオーソログの発現量が関与することを証明でき、当初予定していたとおりの段階まで研究を進めることができた。さらに、研究代表者が実施してきたRdDMの増強系を改変した実験系の有効性を検討することを含め、関連した研究を幅広く行うことができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
前年度の研究において、エピジェネティックな変化の誘導に影響する要因として、DNA脱メチル化に関与するタンパク質がRdDMの誘導に与える影響を明らかにした。研究代表者は、エピジェネティックな機構を利用した分子育種を推進する上で、このようなRdDMの誘導と並ぶ重要な課題として、いったん起きたエピジェネティックな変化がどのように細胞分裂を経て伝達されるか、その安定性を明らかにすることが挙げられるものと考えている。研究代表者が従来より研究に用いているペチュニアのある系統では、いったん起きた花弁の色素合成系の遺伝子のRNA分解に伴って生じる花弁が着色しなくなる形質が10世代を経ても安定である。しかしながら、この系統の植物体を約1年以上の期間にわたり維持していると、花弁の着色が徐々に起きることを見出している。この現象が起きる過程でプロモーター領域のDNAメチル化を含むエピジェネティックな変化が進行しているものと推察されたことから、本研究では、これまで用いてきたRdDMの誘導系に加え、この現象を利用してエピジェネティックな変化の誘導の過程等を明らかにする。具体的には、低分子RNAの網羅的解析、bisulfite sequencingによるDNAのメチル化の解析等により、エピジェネティックな変化の誘導機構を解析する。さらに、可視的な変化を経時的に調べることにより、いったん起きたエピジェネティックな変化がどのように細胞分裂を経て伝達されるか、その安定性に関する知見を得る。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初、本研究費での購入を予定していた機器（PCR機）と本質的に同じ機能を持つ機器が近隣の研究室に配備されたことから、その機器を使用して本研究を進めることとし、同機器の本研究費での購入を取りやめて経費を節減した。また、研究補助員の雇用を予定していたが、これを取りやめ、研究代表者と大学院生により研究を実施した。
経費の節約により生じた未使用額については、今年度に行う組織学的解析のための振動刃ミクロトームの購入ならびにその使用に関わる消耗品の購入に用いる。
|
