2016 Fiscal Year Annual Research Report

A novel gene of seed vernalization that regulates life histories of winter annuals

Research Project

Project/Area Number	25292015
Research Institution	Fukui Prefectural University
Principal Investigator	吉岡俊人福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (10240243)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2018-03-31
Keywords	種子春化 / 新奇花成遺伝子 / 冬生一年草 / 生活史進化 / ヒメムカシヨモギ / オオアレチノギク / マイクロビーズアレイ / 5’RACE
Outline of Annual Research Achievements	冬生一年草は可変性冬生一年草と真性冬生一年草に分化している。種子春化は、可変性冬生一年草には認められるが真性冬生一年草では認められない形質であり、一方、緑体春化は可変性冬生一年草、真性冬生一年草ともに認められる。したがって、種子春化は、近年分子機構の解明が進んだ緑体春化とは異なる経路で花成を誘導すると考えられる。モデル植物であるシロイヌナズナの早期開花系統（ColおよびLer）では種子春化の形質が現われない。そこで本研究では、種子春化の表現型が明瞭に観察できる可変性冬生一年草のキク科野生植物ヒメムカシヨモギ（Erigeron canadensis）と同属近縁種だが種子春化の形質を有しないオオアレチノギク（E. sumatrensis）を実験材料としている。平成27年度までに、ヒメムカシヨモギからマイクロビーズアレイで種子春化候補遺伝子ILS1を単離し、5’RACEで全鎖長の塩基配列を決定した。平成28年度には、ILS1の塩基配列を参考にオオアレチノギクからオルソログ遺伝子CsILS1を単離した。両遺伝子のORFを決定して塩基配列を読んだところ高度に一致した。また、ヒメムカシヨモギILS1の発現は種子の低温遭遇誘導パターンとよく合ったがオオアレチノギクCsILS1は合致しなかった。これらから、冬生一年草の生活史分化の鍵形質である種子春化の有無はILS1の発現調節で制御されている可能性が高いと考えられる。また、ILS1は緑体春化遺伝子を含めて既知の花成関連遺伝子とは類似していなかった。したがって、ILS1の種子春化機能を確定することで新奇花成制御系の発見が期待される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初計画では、平成28年度にヒメムカシヨモギILS1遺伝子ORFをシロイヌナズナの種子春化機能喪失変異型株に導入し、種子春化の機能が相補されるかどうかを検討する予定であった。ところが、変異型株を入手できるシロイヌナズナ早期開花系統（ColおよびLer）を通常の条件で栽培すると種子春化の表現型が現われないことが判明した。そのため、種子春化を検出できるシロイヌナズナ系統を探索して栽培条件を確立する必要が生じた。また、ILS1のORF決定に再度の5’RACE実験が必要となった。以上の状況から、研究の進展がおよそ一年遅れていると評価される。
Strategy for Future Research Activity	平成28年度にヒメムカシヨモギILS1遺伝子ORFを決定し、種子春化を検出できるシロイヌナズナ系統を選抜した。そこで、研究期間を1年間延長し、ILS1の高発現コンストラクトをシロイヌナズナに導入し、T3個体の種子春化性を検定する。また、シロイヌナズナ系統（Col）で種子春化を検出できるアッセイ系を確立したので、ILS1のホモログ遺伝子にT-DNAが挿入されたシロイヌナズナ（Col）の種子春化性を調べる。これら２つのアプローチから、ILS1の種子春化機能を検討する。
Causes of Carryover	平成28年6月に5'RACEによってヒメムカシヨモギILS1を取得したが、予想と異なり翻訳開始点のすぐ下流に終止点が存在した。そこで、ヒメムカシヨモギにおいて再度5'RACEを行う必要が生じた。結局ILS1 ORFが得られたが、ヒメムカシヨモギの近縁種オオアレチノギクのILS1ホモログの塩基配列を決定して、ILS1 ORFが正しいことの確証を得ることとした。また、シロイヌナズナのILS1相同遺伝子は2種類のアイソフォームから成っていたため、機能相補性実験に用いる遺伝子ノックアウト株を得るには、両遺伝子変異体の交配による二重変異体の作製が必要になった。以上の当初計画とは異なる状況から、翌年度にILS1 ORFを高発現で導入したシロイヌナズナ形質転換体およびシロイヌナズナILS1ホモログの二重変異体を作成する計画とし、この実験に必要な人件費、物品費、旅費等合計600,033円を繰越した。