中国原産の完全甘ガキに存在する特異な甘渋性制御遺伝子の単離とその育種への応用

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25292020
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 米森 敬三 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10111949)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 明彦 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, その他部局等, 研究員 (30355440) ; 神崎 真哉 近畿大学, 農学部, 准教授 (20330243) ; 山根 久代 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 講師 (80335306)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 園芸学 / 植物 / ゲノム / 甘渋性 / タンニン

Research Abstract

本年度はまず、これまで‘羅田甜柿’と‘晩御所’の交雑後代集団を用いて構築したAFLPマーカーが、‘羅田甜柿’と‘岩瀬戸’あるいは‘四つ溝’を交雑して得られた後代集団においても有効であるかどうか、また、これまでのマーカーと目的遺伝子（CPCNA遺伝子）との距離関係が同様に確認できるかどうかを調査した。その結果、これまでCPCNA遺伝子座と最も近いと考えられていたマーカーRO-6は、これらの交雑集団においても有効であり、さらにこれらの集団では適合率がより近いことが示され、RO-6とCPCNA遺伝子座との遺伝距離がより近い可能性が示された。
さらに、カキの近縁二倍体種マメガキ（D. lotus）より作製したBACライブラリーを利用した‘羅田甜柿’が有するCPCNA遺伝子の単離の可能性を調査した。その結果、PCR増幅産物の塩基配列からRO-6領域と相同性の高い塩基配列がある事が確認できたため、この領域をプローブとしてBACライブラリーをスクリーニングし、6クローンを検出した。現在、これらのクローンのエンドシークエンスを利用したクローンの整列化を実施している。
なお、SSH（suppression subtractive hybridization）分析より単離したタンニン蓄積に関与する可能性があると考えていた候補遺伝子DkSCPLの機能をポプラの形質転換により調査したが、成葉のタンニン組成には顕著な差異が認められなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに‘羅田甜柿’と‘晩御所’の交雑後代集団から構築した中国タイプの甘ガキ性を決定する遺伝子CPCNAに連鎖するDNAマーカーが‘晩御所’以外の交雑集団においても機能することを確かめるとともに、マーカーRO-6がCPCNA遺伝子座に最も近いことも確かめることが出来た。さらに、このRO-6マーカー領域との相同領域がカキの近縁二倍体種マメガキにも存在することを明らかにするとともに、この領域をプローブとしてマメガキのBACライブラリーからクローンを単離し、マメガキのBACライブラリーを利用してCPCNA遺伝子を単離する可能性が示されたことは今後の実験を進める上で非常に価値ある実験結果である。ただ、ポプラを用いた遺伝子解析のための形質転換実験は当初の予測に反して、満足できる結果を得ることが出来なかった。以上、全体の研究結果を総合的に判断して、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

まず、中国で新たに発見されたPCNA‘甜宝蓋’を用いた交雑個体集団に関しても、構築したマーカーとCPCNA遺伝子の連鎖関係を検証する。また、これまでにAFLP分析から構築した分子マーカーの領域をプローブとして用い、マメガキのBACライブラリーからクローンを単離し、そのエンドシークエンスを解析することでこれらのクローンを整列化し、CPCNA遺伝子座決定のためのシードクローンを決定した後、BACクローンでのコンティグを作製することで、CPCNA遺伝子座周辺の塩基配列の解析とCPCNA遺伝子の単離を試みる。さらに、CPCNA遺伝子単離が直接的に期待できる‘羅田甜柿’のBACライブラリー作製の可能性を検討するとともに、日本のPCNA品種出現の原因となったタンニン蓄積に関与するAST遺伝子の突然変異によって生じた劣性のast遺伝子と‘羅田甜柿’のCPCNA遺伝子との比較機能解析を目指し、カキでのAST/ast遺伝子座とCPCNA遺伝子座の同定を試みる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初、ポプラでの形質転換系を利用した候補遺伝子の機能解析を計画していたが、この方法が上手く使えない可能性が明らかとなり、そのための経費が一部、次年度使用額として生じた。また、‘羅田甜柿’からのBACライブラリー作成を検討しており、そのための費用として次年度の経費とあわせて使用することも考え、次年度使用額としてプールした。
CPCNA遺伝子単離のために、‘羅田甜柿’を用いたBACライブラリー作成の可能性を検討しており、このライブラリー作製が有効であるとなった場合、その作製は業者に依頼する必要があるので、そのための経費として使用する。また、候補遺伝子が座乗するBACクローンを特定できた場合のそのクローンのシークエンス解析費用としても使用する予定である。