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2013 Fiscal Year Annual Research Report

サリチル酸配糖化酵素を分子標的とした新規プラントアクチベーターの探索

Research Project

Project/Area Number 25292035
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Research InstitutionOkayama University

Principal Investigator

能年 義輝  岡山大学, その他の研究科, 准教授 (70332278)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2017-03-31
Keywords植物 / 酵素 / 生理活性 / 環境調和型農林水産 / プラントアクチベーター
Research Abstract

病害抵抗性誘導剤(プラントアクチベーター)は植物が持つ免疫力を活性化することによって病害防除効果を発揮する薬剤である。殺菌性農薬のように薬剤耐性菌によって効果が打破されない持続性、並びに農薬の散布量や回数を減らすことができる環境負荷低減効果を併せ持つことが特徴で、次世代型の植物保護手法として期待される。代表者は、独自の細胞ベースアッセイ法による化合物ライブラリーの探索から抵抗性誘導活性をもつ7個の植物免疫プライミング剤(インプリマチン)を単離した。そして、その一部が植物免疫ホルモンであるサリチル酸に糖を付加して不活性化するサリチル酸配糖化酵素(SAGT)を阻害して薬効を発揮することを突き止めた。そこで本研究では、実用化が期待されるレベルの強力なSAGT阻害剤の単離同定を目指し、シロイヌナズナのSAGTの一つであるUGT76B1を用いた標的ベース探索を進めている。本年度は、酵素による配糖化の進行具合を蛍光基質によって間接的に定量検出できる反応系(Kumagai et al., AnalBiochem, 2014)を用いたハイスループットアッセイ系を確立した。具体的には、ヒスチジンタグを融合させたシロイヌナズナのサリチル酸配糖化酵素の一つであるUGT76B1タンパク質を大腸菌によって発現精製し、384プレートを用いたSAGT酵素反応におけるコントロール値から算出されるS/B比、CV値、Z’値が基準をクリアするように、緩衝液組成、酵素量、時間、温度等を最適化するバリデーション作業を行った。そして東京大学創薬オープンイノベーションセンター(OCDD)の9,600個のコアライブラリー(終濃度10microM)のHTSを実施して30%以上活性を阻害するヒットを63個得た。現在、HPLCを用いた反応基質の定量によって、再現性と擬陽性排除を目的とした2次スクリーニングを行っている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初の計画では市販化合物ライブラリー(14,400個)をHPLCによって2年掛けてスクリーニングする予定だったが、ハイスループットスクリーニング系の開発導入と東京大学OCDDとの共同研究によって、1年目にして9,600個の化合物の探索を終えて候補薬剤の単離を達成することができた。

Strategy for Future Research Activity

極めて有効な探索系を確立することができたので、当初の計画を大幅に超えた22万個の化合物のスクリーニングを実施する予定である。また、補完的手法として計画しているSICLOPPS法についても方法論の確立を目指す。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

探索方法の変更により、当初計画していたHPLCの購入を取りやめたため。また東京大学創薬オープンイノベーションセンターの化合物ライブラリーを使用したことにより、市販の化合物ライブラリーを購入する必要がなくなったため。
今後探索規模を22万化合物に拡大するにあたり、探索のための人件費、旅費、化合物購入費用として使用する。

  • Research Products

    (7 results)

All 2014 2013

All Journal Article (2 results) Presentation (5 results) (of which Invited: 3 results)

  • [Journal Article] 植物免疫プライミング剤の単離と作用機序解明2014

    • Author(s)
      能年義輝
    • Journal Title

      岡山大学農学部学術報告

      Volume: 103 Pages: 408-418

  • [Journal Article] 化合物探索から見出した新規サリチル酸アゴニストを利用した植物免疫ホルモンの作用機序解明2013

    • Author(s)
      能年義輝
    • Journal Title

      倉田奨励金研究報告

      Volume: 43 Pages: 10-11

  • [Presentation] Identification of a small molecule inhibitor for the salicylic acid signaling pathway2014

    • Author(s)
      石濱伸明・能年義輝・崔勝媛・Saska Ivana・野村有子・中神弘史・村山和隆・白水美香子・斎藤臣雄・長田裕之・白須賢
    • Organizer
      第55回日本植物生理学会年会
    • Place of Presentation
      富山大学五福キャンパス
    • Year and Date
      20140318-20140320
  • [Presentation] Isolation and characterization of plant immune-priming chemicals2014

    • Author(s)
      Yoshiteru Noutoshi
    • Organizer
      Okayama University CAMPUS Asia Pilot Program, Winter Seminar on Life and Material Sciences in Okayama
    • Place of Presentation
      Okayama University 50th Anniversary Hall
    • Year and Date
      20140123-20140124
    • Invited
  • [Presentation] ブラキポディウムを使った病害抵抗性誘導剤探索の可能性2013

    • Author(s)
      能年義輝
    • Organizer
      第2回ブラキポディウムワークショップ
    • Place of Presentation
      岡山大学資源植物科学研究所
    • Year and Date
      20131129-20131129
    • Invited
  • [Presentation] 利尿剤はシロイヌナズナにおいて植物免疫プライミング剤として作用する2013

    • Author(s)
      能年義輝・池田美香・白須賢
    • Organizer
      平成25年度日本植物病理学会関西部会
    • Place of Presentation
      岡山大学50周年記念館
    • Year and Date
      20130926-20130927
  • [Presentation] A Chemical Biology Approach to Understanding Plant Immunity2013

    • Author(s)
      Yoshiteru Noutoshi
    • Organizer
      Symposium on Plant Genetic Resources in East Asia (JSPS Asian CORE Program
    • Place of Presentation
      Okayama University 50th Anniversary Hall
    • Year and Date
      20130924-20130925
    • Invited

URL: 

Published: 2015-05-28  

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