2013 Fiscal Year Annual Research Report
放線菌の土壌環境適応戦略に関わる遺伝子発現制御機構の解明
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25292040
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | National Institute for Agro-Environmental Sciences |
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Principal Investigator |
藤井 毅 独立行政法人農業環境技術研究所, その他部局等, 領域長 (00354100)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋藤 明広 静岡理工科大学, 理工学部, 准教授 (50375614)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 遺伝子発現制御 / 転写カスケード / キチナーゼ / 抗生物質生産 / 放線菌 / 転写因子 |
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| Research Abstract |
土壌においてキチン代謝関連遺伝子群や抗生物質生産遺伝子群の発現を制御することが明らかとなった転写因子遺伝子の発現を左右する制御因子を明らかにするため、磁気ビーズに同転写因子遺伝子上流配列を固定化し、その転写調節領域に特異的に結合するタンパク質をスクリーニングするためのアフィニティーバインディングアッセイ系を確立した。その転写調節領域には同転写因子タンパク質自体が結合する配列も存在することから、このビーズを用いて同転写因子を単離精製するアフィニティー精製法を確立した。また、その転写因子によって制御されているパスウェイ特異的な発現制御遺伝子上流に存在すると考えられる転写因子結合配列を同定するため、精製した転写因子タンパク質を用いたゲルシフトアッセイ系を確立した。
さらにこの転写因子の遺伝子やその標的遺伝子の発現を定量するRT-PCR実験系を確立し、これまでに取得しているキチナーゼ生産に異常をきたした変異株における同転写因子遺伝子の発現量を解析したところ、欠損することによってその転写因子の遺伝子の発現が高まる遺伝子を見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
土壌においてキチン代謝関連遺伝子群や抗生物質生産遺伝子群の発現を制御することが明らかとなった転写因子について当初計画していた、①転写因子タンパク質を用いたゲルシフトアッセイ系の確立、②転写因子遺伝子上流領域へ結合するタンパク質の精製系の確立、③転写因子遺伝子や抗生物質生産遺伝子の発現を定量するRT-PCR実験系の確立を達成すると共に、新たに、同転写因子の発現を制御する新たな制御因子の存在が示唆され、大きな進展が認められた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度確立したアフィニティーバインディングアッセイ系を用いて、土壌においてキチン代謝関連遺伝子群や抗生物質生産遺伝子群の発現を制御する転写因子遺伝子の転写調節領域に特異的に結合するタンパク質のスクリーニングを行う。また、精製した転写因子タンパク質を用いたゲルシフトアッセイ系を用いて、その転写因子が制御するパスウェイ特異的な転写因子の遺伝子上流に存在すると考えられる転写因子タンパク質結合配列を同定する。さらに、本年度新たに見いだした同転写因子遺伝子の発現を制御していると考えられる遺伝子の破壊株を作成し、同破壊株における二次代謝や一次代謝等の生理的特徴を明らかにするとともに本転写因子の大量生産を試みる。また、土壌の各種分画画分を放線菌培養液に添加し、定量RT-PCR実験系を用いてキチナーゼや抗生物質生産遺伝子の発現を高める活性を有する画分を精製する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究を担当するため雇用した契約職員（ポスドク）が年次有給休暇をとり、当初交付金で充当した結果、当初見込額よりも人件費・謝金の支出が少なくなったため。
来年度は、アフィニティーバインディングアッセイや、精製した転写因子タンパク質を用いたゲルシフトアッセイなど、高価な分子生物学試薬を多く使う実験が増えることから、各種分子生物学キットや試薬の購入に次年度使用額を重点的に使用する。
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