2013 Fiscal Year Annual Research Report
セルロースの酵素分解を促進する黄色色素の促進機構の解明および新規黄色色素の単離
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25292049
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
粟冠 和郎 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (20154031)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
粟冠 真紀子 三重大学, 生物資源学研究科, 学術研究員 (00422882)
五十嵐 康弘 富山県立大学, 工学部, 教授 (20285159)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 黄色色素 / セルラーゼ / セルロソーム / セルロース分解 / セロビオヒドロラーゼ / エンドグルカナーゼ |
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| Research Abstract |
本研究は、①C. thermocellum由来の黄色色素の化学構造の決定、②黄色色素のセルロース分解促進機構の解明、③C. thermocellum以外のセルロース分解菌からの黄色色素の単離と構造解析、④C. thermocellum由来の黄色色素と構造の類似した天然化合物または合成化合物のClostridiumおよび糸状菌由来のセルロース分解活性の促進効果の検討、⑤天然バイオマス分解への黄色色素の応用、を目的としている。
C. thermocellum由来の黄色色素の化学構造を決定するため、精製法を検討した。菌体をアセトンで抽出することにより黄色色素画分を得た。濃縮方法やカラムの分離条件を検討した結果、シリカゲルカラムにより黄色色素を回収することが出来た。質量分析の結果、分子量は約407と予想された。また、1H-NMRの結果から、カロテノイドの一種であるが、既知の物質とは異なることが予想された。本物質は不安定であるため、構造決定のために安定な条件を見つける必要性がある。
黄色色素のセルロース分解促進機構を解明するため、C. thermocellum由来のセルラーゼとキメラ骨格タンパク質からなる酵素複合体を形成し、黄色色素を吸着させた微結晶セルロース（フナセル）またはボールミルセルロースに対する分解活性を測定した。酵素としてCbh9A、Cel9KおよびCel9Rを用いたとき、それらの複合体は、黄色色素を吸着させたフナセルに対して、未処理のものに比べて約３倍の活性を示した。一方、Cel9Tでは、黄色色素の分解促進効果は見られなかった。Cel9Rなどはセロビオヒドロラーゼまたはプロセッシブエンドグルカナーゼであるのに対して、Cel8Aはエンドグルカナーゼであるため、黄色色素はプロセッシビティーの高い酵素に働く可能性が示唆された。β－カロテンにも黄色色素と同様の効果があることが見いだされた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、①C. thermocellum由来の黄色色素の化学構造の決定、②黄色色素のセルロース分解促進機構の解明、③C. thermocellum以外のセルロース分解菌からの黄色色素の単離と構造解析、④C. thermocellum由来の黄色色素と構造の類似した天然化合物または合成化合物のClostridiumおよび糸状菌由来のセルロース分解活性の促進効果の検討、⑤天然バイオマス分解への黄色色素の応用、を目的としている。
当初の計画では、①～③を推進する予定であった。①については、精製法を確立し、予備的な分析を行うことにより、カロテノイドの一種であることが予想された。完全な構造決定にはまだ至っていないが、これは黄色色素が不安定であるためであり、安定化するための条件を検討中である。②については、いくつかのセルラーゼを発現させ、それらの酵素の黄色色素吸着セルロースに対する活性を調べた結果、黄色色素がプロセッシビティーの高い酵素の活性を高めることを見いだした。③については、今年度は開始できなかったが、④に関連して、β－カロテンにも黄色色素と同様の効果があることを見いだした。
以上のように、一部難航しているものもあるが概ね順調に進展していると自己評価している。
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| Strategy for Future Research Activity |
黄色色素の化学構造の決定に際して、その不安定性が問題となっている。具体的には、精製後の活性が低下することである。これを避けるため、抽出方法、保存方法、分離方法、検出方法の各過程を再検討する必要があると考えている。
黄色色素のセルロース分解促進機構の検討は、粗抽出液を用いて行える。今年度と同様に、酵素複合体を用いて検討するが、今年度はより大きな骨格タンパク質を用いる予定である。また、セルロソームを形成しないセルラーゼについても使用する予定である。
β－カロテンに、黄色色素と同様の活性があることが見いだされたことから、この物質のセルラーゼ活性の促進効果を黄色色素の場合と同様の手法で詳細に調べる予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今年度、C.thermocellum由来の黄色色素の分離法や精製法を検討し、構造に関する基礎的なデータを得ることが出来た。しかし、その一方で黄色色素が不安定であることが判明し、その精製や構造解析に経費がかかることが予想されたため、経費を残した。
C.thermocellumの培養法（培地の検討も含む）、抽出法、保存法、精製法、活性の測定法など、各段階について再検討する。そのための試薬および機器の購入費用に充てる。
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