2013 Fiscal Year Annual Research Report
植物による病原細菌由来エフェクタータンパク質の細胞内認識と免疫反応誘導の機構解析
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25292067
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
蔡 晃植 長浜バイオ大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (00263442)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 植物免疫 / 分子間相互作用 / エフェクター / PAMP / プロテインキナーゼ / 細胞内情報伝達 / ETI / PTI |
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| Research Abstract |
植物の免疫システムの一つであるETI（Effector-triggered immunity）の誘導は、病原菌感染の成立・不成立を左右する重要なステップである。そこで本研究では、イネと植物病原細菌Acidovorax avenaeを用いて植物による病原細菌認識と免疫反応誘導の分子機構を明らかにすることを目的として行った。
平成25年度の研究ではまず、これまで明らかにしたエフェクターであるEFSタンパク質以外のエフェクターを同定するため、イネに対して非病原性のA. avenae N1141菌株のトランスポゾン挿入変異体ライブラリーを作製し、イネの過敏感細胞死誘導能を欠損した変異体をスクリーニングした。その結果、イネの免疫反応誘導能を欠失した5つの変異株が認められたので、これらの変異株についてトランスポゾン挿入遺伝子を解析したところ、tRNA delta(2)-isopentenylpyrophosphate transferase（IPPT）遺伝子を同定することが出来た。そこで次に、IPPTがイネの細胞死誘導因子であるかどうかを明らかにするため、IPPTをイネプロトプラスト内で一過的に発現させたところ、細胞死が誘導された。また、この細胞死には過敏感細胞死マーカーであるOsNAC4誘導が付随したことから、IPPTが誘導する細胞死が植物免疫反応である過敏感細胞死であることが示された。さらに、IPPTタンパク質はイネ以外の非宿主植物に対してはエフェクターとして機能しないことも明らかとなり、IPPTはイネ特異的なエフェクタータンパク質であることが初めて示された。興味深いことに、親和性のK1菌株由来のIPPTはイネの免疫反応を誘導しないことも明らかになり、K1とN1141菌株由来のIPPTに存在するアミノ酸配列の違いが免疫反応誘導の特異性を決定しているという興味深い知見が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成25年度にはEFSの認識機構と共に、EFS以外の免疫反応誘導に寄与するエフェクターの存在を調べることが研究の目的でもあった。EFSについては、イムノフィリン様タンパク質とイネ細胞内で相互作用することを示すことが出来た。また、イネに対して非病原性のA. avenae N1141菌株のトランスポゾン挿入変異体ライブラリーを作製し、イネの過敏感細胞死誘導能を欠損している変異体をスクリーニングすることで、IPPTというこれまで全く報告の無かった遺伝子をエフェクター候補遺伝子として同定することが出来た。また、この分子がエフェクターとして機能するかどうかを、この遺伝子の欠損株作製や植物細胞内での一過的発現などで調べることが出来ただけでなく、IPPTを細胞内発現させたときに認められるイネの細胞死が植物免疫反応の一つであることを過敏感細胞死のマーカーあるOsNAC4を用いて明らかにすることが出来た。また、当初は全く予想もしていなかったが、親和性のK1菌株由来のIPPTはイネの免疫反応を誘導しないことも明らかになった。K1とN1141菌株由来のIPPTに存在するアミノ酸配列の違いは数アミノ酸であるにもかかわらず、免疫反応誘導の特異性があることは、この数アミノ酸の置換がイネに対するこの菌の親和性、非親和性を決定しているという分子生物学的にも非常に興味がもたれる知見である。このことから、今後、N1141菌株のIPPTだけでなくK1菌株のIPPTだけも利用することで、研究が当初の予想より大きく飛躍する可能性が出てきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で明らかにした様に、K1菌株由来のIPPTは、N1141菌株のIPPTと数アミノ酸しか違わないのに、イネの免疫反応を誘導できない。このことは、この数アミノ酸の置換がイネに対するこの菌の親和性、非親和性を決定しているということを示す。そこで、本年度からはこれまで明らかにしたエフェクターの中でも特にIPPTを中心にして研究を進めていきたい。
まず、このIPPTが実際にイネ細胞内に分泌されているかどうかをCYA融合タンパク質で調べる。また、このIPPTによるETI誘導活性に、IPPTの酵素としての活性が必要かどうかをIPPTの活性阻害剤や不活性化タンパク質を用いて明らかにする。さらに、IPPTと結合するイネのタンパク質を酵母Two-hybrid法やBiFC法、免疫沈降法、TAP法、Biacore法、などの手法を用いて明らかにしたい。同時にIPPT結合タンパク質が明らかになったら、K1菌株由来のIPPTとの結合も調べ、両IPPT間に存在する免疫反応誘導特異性が受容体との結合の差によるのかを調べたい。また、EFSやIPPTのエフェクター受容体の認識情報伝達にタンパク質リン酸化とカルシウムシグナルが関与するかについても、我々がこれまで明らかにしたCPK12というカルシウム依存性プロテインキナーゼやMAPKとの関連も含めて明らかにする。
同時にEFSやIPPT以外のエフェクター分子についてもトランスポゾンタギングラインを用いて継続的に探索を行うと共に、新たにN1141菌株とK1菌株の全ゲノムを明らかにし、そのゲノム情報を用いて両菌株間で異なる構造を持つ分子についての探索を開始したい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度にはEFSの認識機構と共に、EFS以外の免疫反応誘導に寄与するエフェクターの存在を調べることになっていた。研究は順調に進み、EFSについては、イムノフィリン様タンパク質とイネ細胞内で相互作用することを示すことが出来た。一方、イネに対して非病原性のA. avenae N1141菌株のトランスポゾン挿入変異体ライブラリーを用いて、IPPTというこれまで全く報告の無かった遺伝子をエフェクター候補遺伝子として新たに同定することが出来た。そこで、まず、このIPPTの同定と機能確認を優先して行ったため、本来作製を予定していたベクターの数が少なくなった。そのため、購入を予定していた遺伝子増幅装置をベクター作製数が多くなる平成26年度以降に購入することになり、次年度使用額が生じることとなった。
本年度はEFSの機構について調べるのと同時に、新たにIPPTによる免疫反応誘導の分子機構解析を開始する。IPPT機能解析では、IPPTと結合するイネのタンパク質を酵母Two-hybrid法やBiFC法、免疫沈降法、TAP法、Biacore法、などの手法を用いて調べたり、その下流の情報伝達系についても解析をすることになる。この様な研究には、多くのベクターが必要となるため、平成26年度の研究開始と同時に遺伝子増幅装置の購入が必要となる。また、IPPTと相互作用するタンパク質の解析や情報伝達解析には、多くの抗体や生化学的試薬が必要となる。さらに、本年度からの研究では新たなエフェクターの探索を行うために両菌株の全ゲノム解析を予定しており、この解析にも多くの資金が必要となる。また、本年度は本研究の成果を海外の学会で発表することを予定しており、予算は順調に使用できるものと考える。
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