2013 Fiscal Year Annual Research Report
代謝のキー制御因子としての摂食タイミングの分子作用機序と中枢－末梢時計の同調機構
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25292069
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
小田 裕昭 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (20204208)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 時間栄養学 / 概日時計 / 時計遺伝子 / メタボリック・シンドローム / 肝臓時計 |
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| Research Abstract |
規則正しい食生活は、健康によいとされている。何をどれだけ食べるかは、いまでも重要な課題であるが、どのようなタイミングで「いつ」食べるかなどについて、分子生物学的研究は十分にされていない。一方、時間生物学の進歩により時計遺伝子が発見されて、生物時計の分子生物学は進み、すべての細胞が概日リズムを持つことが明らかとなった。時計遺伝子の改変動物で代謝異常が示されるようになってきたが、私は不規則な摂食タイミングだけで代謝異常が起きることを初めて示した。本研究では、摂食タイミングは、代謝のキー制御因子であることを示し、その分子メカニズム明らかにするために以下の実験を行った。
ラット初代培養肝細胞をEHS-gelにより3次元培養させて、肝細胞の概日リズムを維持させた培養肝細胞を用いた。肝細胞のリズム発振機構に関して、これまでは細胞形態や細胞外マトリクスに注目して研究を行ってきたが、本年度は細胞内の情報伝達に焦点をあてた。特に細胞骨格タンパク質の影響を重合、脱重合阻害剤を用いて検討した。微小管重合阻害剤であるコルヒチン、ビンズラスチン、ノコダゾールを処理するとDBP遺伝子発現の概日リズムが顕著に抑制された。このことは肝細胞の概日時計維持に微小管が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。一方パクリタキセルにより微小管の脱重合を阻害すると平面培養した肝細胞の概日リズムが顕著になったことから細胞形態に依存した概日時計は微小管に強く依存していることが明らかとなった。アクチンフィラメントや中間径フィラメントの関与はほとんどないことも明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度には、上述した実験の他シグナルトランスダクションにかかわる実験を行う予定であったが、それを進めることができなかった。細胞骨格タンパク質による肝細胞の概日時計制御が、推測していた以上に重要であることがわかったため、詳細に調べた結果である。また、初代肝細胞培養法の確実な継承などにも時間がかかったためである。
現在も解析中であるため実績では記載しなかったが、摂食タイミングを崩壊させた動物実験も行った。本実験ではこれまでとは異なり、ヒトの夜食症候群に対応する実験とシフトワーカーを意識した実験を行った。ラットは休息期だけ摂取させた夜食症候群モデルや、摂食タイミングを明期と暗期を一週間ごと変えたシフトワーカーモデルを用いたところ、いずれの場合でも血中コレステロールが上昇していた。これがどのような理由により起こったか現在解析中であるが、ヒトで起こる現象をラットで再現させることができたことを成果であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
3次元培養したラット初代培養肝細胞を用いて、細胞形態や細胞外マトリクスが概日リズムに与える影響のシグナルトランスダクション経路を明らかにする。主にリン酸化、脱リン酸化酵素に注目して研究を行う。具体的には、カゼインキナーゼ、GSK-3b、PKA、AMPK、チロシンキナーゼの阻害剤と脱リン酸化阻害剤であるバナジン酸、オカダ酸を6時間と18時間処理し、時計遺伝子のmRNAと転写速度を測る（Per1,2, Cry1,2, Clock, Bmal1, RORa, Rev-erba, Dec1,2, DBP, TEF, HLF, E4BP4）。
ヒト肝細胞での制御を明らかにするため、高機能を維持しているヒト肝細胞株であるFLC-4細胞を用いて同様な実験を行う。
H25年度に行った動物実験で得られた肝臓からRNAを抽出して、マイクロアレー解析ならびにリアルタイムPCR解析を行う。
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