2014 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子操作と結晶構造解析による主要小胞体分子シャペロンER-60の機能解析
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25292070
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
裏出 令子 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (90167289)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
裏出 良博 筑波大学, 学内共同利用施設等, 教授 (10201360)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 酵素 / 小胞体 / アルツハイマー病 / ノックアウトマウス / 結晶構造解析 / 分子シャペロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. ER-60-floxマウスにCre-アデノ随伴ウイルス粒子を接種して、脳神経細胞特異的に内因性ER-60をノックアウトし、さらにラットのER-60を強制発現させたマウスの作製に成功した。ER-60ノックアウトマウスとこのマウスの脳室内にアミロイドβペプチドを脳脊髄液に溶かして注射し､脳神経細胞への影響を検討した｡ノックアウトマウスではアミロイドβペプチドを注射して10日後に海馬でER-60欠損細胞のみが脱落するが、ラットER-60を強制発現させたマウスでは神経細胞死が抑制されることを明らかにした。
2. ER-60-siRNAによりER-60をノックダウンさせたヒト培養細胞HEK293にER-60のb-b'ドメインを強制発現させるとアミロイドβペプチドの毒性に対する抵抗性が回復するが、この作用は小胞体で発揮されていることを明らかにした。すなわち、b-b'のN末端にシグナルペプチドを添付して小胞体に発現させた場合にはアミロイドβペプチドの毒性に対する抵抗性効果が発揮されるが、細胞質に発現させて場合には効果はみられなかった。
3. 平成25年度に明らかとなった結合に必須のアミノ酸残基2個をアラニンに変異させたリコンビナントb-b'およびアミロイドβペプチドとの複合体の結晶を地上および国際宇宙ステーション日本実験棟で作製した。作製した結晶の構造解析を行い、これらの変異体タンパク質の立体構造は野生型と同じであるが、アミロイドβペプチドが結合していないことを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度の研究で、ER-60の存在がアミロイドβペプチドによる海馬での神経細胞の脱落を抑制していることを証明することができた。また、細胞レベルではER-60の細胞内局在場所である小胞体でアミロイドβペプチドの毒性を抑制していることを明らかにした。アミロイドβペプチドの毒性をER-60のb-b'領域だけで抑制することができることから、in vitroで明らかにしてきたb-b'領域とアミロイドβペプチドとの結合を介して毒性を抑制していると考えられる。そして、アミロイドβペプチドとの結合に必須のb-b'のアミノ酸残基を結晶構造解析から示すことができた。以上のように、本プロジェクトは順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．小胞体機能に対するER-60欠損の影響をタンパク質の立体構造形成に関わる分子シャペロン量などを比較することで明らかにしていく。２． ER-60のAβ重合化阻害機構を解明するために、さらに精密化した変異b-b’とAβ複合体の結晶構造解析を進める。３．ER-60の脳での発現量と糖尿病、肥満、睡眠と加齢などのADのリスク因子との関係を解明することを目的に、リスク因子を持つモデルマウスを用いて検討する。
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| Causes of Carryover |
他の研究費で人件費を出費することができたため、人件費が予定額よりも下回った。一方、計画していたノックアウトマウスの実験が順調に進んだため組み換え実験を多く行い、物品費の支出総額が当初の予定よりも多くなったが、全体としては予定額を下回った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
26年度に予想以上に研究が進んだためマウスを用いる実験の数を増やし、より誤差の少ない精度の高いものとする。その費用にH27年度に繰り越した研究費を当てる。
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