2014 Fiscal Year Annual Research Report
人工モノクローナル魚類抗体の迅速作出法の開発およびその応用
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25292125
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
近藤 秀裕 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 准教授 (20314635)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣野 育生 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 教授 (00270926)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 免疫学 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、Edwardsiella tarda死菌およびスカシガイヘモシアニン（KLH）で免役したヒラメの血球を対象に、発現している抗体重鎖遺伝子の多様性を解析した。各サンプル100弱の配列を解析し比較したところ、免疫後も配列の多様性は高いままであり、抹消白血球における抗体価の上昇に伴うB細胞クローンの増加は観察されなかった。
さらに、各抗原で免役した個体の白血球由来の抗体遺伝子を用いて、一本鎖抗体多様性鎖(single chain Fv: scFv)を調製し、ファージディスプレイ法により抗原特異的なscFv断片の単離を試みた。それぞれ個別にscFvを調製し、ファージディスプレイライブラリを作製した。バイオパニング法により抗原特異的に結合するscFv断片の調製を試みたが、抗原特異的なクローンを単離することはできなかった。
また、異なる水温で飼育したヒラメをE. tarda死菌で免役した際に脾臓で発現変動する遺伝子を調べるため、マイクロアレイ解析を行った。E. tarda死菌の投与に伴い、多くの遺伝子でmRNA量の変化がみられた。とくに、インターフェロン（IFN）γで発現が誘導されることがほ乳類で報告されている遺伝子において、発現動態への水温の影響がみられた。これまでの研究でＩ型IFNで発現誘導される遺伝子も水温の影響を受けることが示されている。抗原投与による特異抗体の成立は水温に大きく影響を受けることから、IFNにより制御される遺伝子群が特異抗体の成立に深く関わる可能性が考えられた。
このほか、ヒラメにおいて抗原提示や白血球の活性化に関わる種々の遺伝子についてcDNAクローニングを行うとともに、発現解析および機能解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、魚類のモノクローナル抗体を人工的に調製することを目的としている。平成26年度はヒラメを主に用い、免疫に伴う抗体重鎖遺伝子の多様性の変化を解析した。さらに、遺伝子工学的な手法を用い、魚類人工モノクローナル抗体の調製を試みた。
一方、魚類の特異抗体が成立する過程に関わる機構を解明するため、網羅的な遺伝子発現解析を行い、IFNが抗原特異的な抗体の産生に影響していることを示唆するデータを得た。さらに、ヒラメにおいて抗原提示や白血球の活性化に関わる種々の遺伝子の同定を行ってきた。
このように、魚類のモノクローナル抗体を単離するためのアプローチとして、直接的方法および間接的方法を織り交ぜて進めてきており、研究はおおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度までに魚類の人工モノクローナル抗体を調製することを目的としてファージディスプレイライブラリーを構築し、抗原特異的な魚類scFvの単離を試みたものの単離には至らなかった。これは、血中抗体価が上昇していたとしても、抹消白血球中のB細胞が特異抗体を産生していなかった可能性も考えられる。また、特異的なscFvを単離するためのバイオパニング法にも問題があった可能性がある。そこで本年は、抗原特異的な抗体産生細胞が多く存在していると考えられる脾臓を対象に、抗原特異的な抗体産生細胞を同定し単離する手法を確立するとともに、これらの細胞から抗体遺伝子断片を増幅し抗原特異的な抗体遺伝子断片を得る手法を検討する。
また、抗原特異的な獲得免疫の成立にIFNが関与している可能性が示唆されたことから、より効率的に抗原特異的な抗体産生細胞を得るため、IFNの獲得免疫成立に及ぼす機能の解析を引き続き行う。
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