2015 Fiscal Year Annual Research Report
人工モノクローナル魚類抗体の迅速作出法の開発およびその応用
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25292125
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
近藤 秀裕 東京海洋大学, その他部局等, 准教授 (20314635)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣野 育生 東京海洋大学, その他部局等, 教授 (00270926)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 免疫学 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度は、魚類の免疫グロブリン陽性細胞の単離を目的として、ヒラメ血中の白血球を対象にヒラメ抗体に対するウサギ抗血清およびマウスモノクローナル抗体を用いて標識を試みた。ヒラメ血中の抗体陽性白血球は全白血球の10％未満であり、その後の解析に供することが難しいことが示された。このことは、様々な魚種のIgM重鎖を認識可能な抗体を用いたウェスタンブロッティング解析において、ヒラメ血清中のIgM量が少ないことと関連していることが示唆された。そこで、上記の抗体を用いた解析で比較的血中のIgM量が多かったコイを対象に、コイ抗体に対するマウスモノクローナル抗体を用いて標識を試みたところ、数十%の細胞が標識された。現在、標識された細胞の単離を試みている。
また、ヒラメを対象に、抗原特異的な獲得免疫の成立に関わる分子機構を明らかとするため、Ｉ型インターフェロン（IFN）および情報伝達因子群についてcDNAクローニングを行い、塩基配列を決定した。さらに、ほ乳類においてDNAワクチンとして抗原分子との融合分子を合成させることにより抗原提示能を活性化すること知られるLysosome-associated membrane protein-1（LAMP-1）を同定し、魚類病原ウイルスの抗原タンパク質遺伝子との融合遺伝子を調製した。本遺伝子断片を真核生物発現用プラスミドに組み込み個体に接種したところ、顕著な抗体価の上昇が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、魚類のモノクローナル抗体を人工的に調製することを目的としている。平成27年度は魚類の免疫グロブリン陽性細胞を単離する目的で、免疫グロブリンに対する抗体を用いた魚類白血球の標識を試みた。さらに、魚類免疫グロブリン重鎖において、多くの魚種間でアミノ酸配列が保存されている領域を見いだし、本領域に対するポリクローナル抗体を調製し解析したところ、魚種ごとに血中の免疫グロブリン量が異なることが示された。とくに、ヒラメでは血中の免疫グロブリン量が少ない傾向が見られたことから、免疫グロブリン陽性細胞の数も異なることが示唆された。
一方、魚類の特異抗体が成立する過程に関わる機構を解明するため、Ｉ型IFNおよびその情報伝達に関わる種々の遺伝子の同定を行い、各遺伝子の発現動態を解析した。さらに、抗原に対してより特異抗体価を高めるための方法として、ヒラメのLAMP-1遺伝子をクローン化し、本遺伝子を用いた組換えDNAワクチンを開発した。
このように、魚類のモノクローナル抗体を単離するための細胞の分離法は徐々に確立されつつあるとともに、抗原に対する特異抗体価を高めるための手法についても検討がなされていることから、本研究は概ね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度までに魚類の免疫グロブリン陽性細胞の標識が可能となった。本年度は、抗体産生細胞のうち、抗原特異的な抗体産生細胞の単離を目的として、魚類抗体および抗原分子を用いた2重染色を試みるとともに、検出された細胞の単離法を開発する。さらに、得られた細胞を対象として、一細胞を対象とした発現遺伝子解析手法の確立を試みる。
また、引き続き抗原特異的な獲得免疫の成立に関わる分子群の機能の解析を行うことを目的として、次世代シークエンサーを用いた網羅的な解析を試みる。さらに、上述のLAMP-1遺伝子を用いて開発したDNAワクチンの効果を検証する。
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