ユビキチン非依存性膜蛋白質小胞体品質管理の謎と偽ロンボイド分子ダーリンの役割

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25292177
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 稲葉 睦 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 教授 (00183179)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山盛 徹 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 准教授 (00512675) ; 佐藤 耕太 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 准教授 (50283974)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 小胞体関連分解 / プロテアソーム / 蛋白質分解 / Derlin

Outline of Annual Research Achievements

小胞体膜に存在する偽ロンボイドプロテアーゼであるDerlinsの役割、特にR664X AE1の分解への影響と分解に関わるプロテアソームを検討するために、平成27年度は以下の2項目について検討を行った

1. Derlinsの小胞体膜における分解機能の重要性を検討するためには、in vitro環境における小胞体膜上の基質蛋白質の発現および検討が必要である。そこで、Microsomeのみを抽出する方法であるSemi-permeabilized cell (SP cell)の作成の検討を行った。その結果、Derlin-1およびDerlin-2のsiRNAによる発現抑制効果を保持したHEK293細胞からMicrosome成分のみを抽出することに成功した。現在、in vitro translationにより合成したR664X AE1とこのSp cell由来のMicrosomeを用いてin vitroにおける小胞体膜に組み込まれたR664X AE1を再現、Derlin-1,2の発現抑制の影響を検討している。
2．基質蛋白質の分解とUb依存性の相違に関わるプロテアソームタイプの解析を行うため、19S,20S、および26SプロテアソームのR664X AE1に対する基質分解に関する特異性と程度の検討を行った。野生型（WT）AE1およびUb依存性の小胞体関連分解を呈することがわかっているΔ508-CFTRをコントロールとして比較したところ、いずれのプロテアソームにおいても有意な差を認められなかった。また、20Sの阻害剤であるラクタシスチン、19Sの阻害剤であるグルコサミンを用いた細胞に対する影響を検討した実験においても有意な差が認められず、基質―プロテアソーム分解に関わる他の必須因子の存在やそれ以外のプロテアソーム（11Sなど）の関連が示唆された。この点については今後改めて検討と実証が必要である。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Causes of Carryover

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

27年度が最終年度であるため、記入しない。