2013 Fiscal Year Annual Research Report
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25292193
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
堀内 浩幸 広島大学, 生物圏科学研究科, 教授 (80243608)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 人工ヌクレアーゼ / TALEN / 鳥類 / ニワトリ / ノックアウト / 多能性幹細胞 / 発生工学 |
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| Research Abstract |
本研究では，鳥類におけるゲノム編集技術を確立することを目的に，鳥類の雄化に関わるHEMGEN遺伝子を標的に人工ヌクレアーゼ（TALEN）を作製し，ニワトリ多能性幹細胞や生殖系列細胞からHEMGENノックアウトニワトリを作出し，その表現型により本技術導入の可否を判断するものである。平成25年度は，HEMGEN遺伝子を標的したTALENを設計・構築し，SSAアッセイによる二重鎖切断（DSB）活性の測定，GFP発現ベクターを用いたTALEN発現ベクターの導入条件の検討，ニワトリ胚性幹（ES）細胞へのTALEN発現ベクターの導入とCel-1アッセイ，変異導入領域の塩基配列の解析を行なった。HEMGENノックアウト用TALEN発現ベクターは３種作製し，SSAアッセイを用いて評価した。その結果，構築した２種の発現ベクターで標準活性の約２倍のDSB活性が認められた。次に，GFP発現ベクターを用いて，ニワトリES細胞やニワトリエピブラスト幹細胞（epiSC）にTALEN発現ベクターを導入する際のエレクトロポレーターの条件を決定した。決定した条件での細胞の生存率は約78%，遺伝子導入効率（GFP陽性率）は約83%であった。決定した条件をもとに，ニワトリES細胞に対してTALEN発現ベクターを導入し，Cel-1アッセイを実施したところ，電気泳動によって変異導入を示す消化断片が観察された。そこで，変異導入領域の塩基配列を解析したところ，HEMGEN遺伝子の開始コドン下流で9塩基が配列の異なる7塩期に置換されていることがわかった。またこの変異導入により，フレームシフトが起こり，変異導入箇所から16塩基目に終止コドンが挿入され，HEMGEN遺伝子のノックアウト変異であることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度は，研究計画調書並びに交付申請書に記載した研究計画が全て実行され，期待通りの成果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度以降は，HEMGEN遺伝子のノックアウト変異誘導ニワトリ多能性幹細胞もしくは生殖細胞と特徴解析を行い，細胞クローニングを行なった後，平成27年度以降にHEMGEN遺伝子ノックアウトニワトリの作出に取組む。
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