2013 Fiscal Year Annual Research Report
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25292200
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
高松 大輔 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究所細菌･寄生虫研究領域, 主任研究員 (60414728)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
芳山 三喜雄 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産草地研究所家畜育種繁殖研究領域, 主任研究員 (10510258)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 昆虫病原微生物 / 養蜂 / ヨーロッパ腐蛆病 / Melissococcus plutonius |
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| Research Abstract |
ヨーロッパ腐蛆病はミツバチ幼虫の致死性伝染病で、家畜伝染病予防法で法定伝染病に指定されている。原因菌であるMelissococcus plutoniusは、約100年前からその存在が知られているものの、培養すると急速に病原性が失われると考えられおり、本病の発病機構は全く明らかになっていない。ところが、近年、研究代表者らは、継代培養を繰り返しても病原性が失われず、実験感染系で幼虫にヨーロッパ腐蛆病を再現可能なM. plutonius株（非典型株）が存在することを発見した。そこで本研究では、この非典型株を詳細に解析することにより、本病の発病機構を明らかにすることを目的とする。本年度は、
１、レンサ球菌で遺伝子破壊に用いている自作の温度感受性プラスミドベクターpSET6sを利用して、M. plutoniusの遺伝子欠損株作出法を確立した。
２、ミツバチ幼虫に感染した菌を病理切片上で検出するための抗M. plutonius血清を作製し、M. plutoniusを注入した動物の肝臓をモデルに、菌が検出可能であることを確認した。
３、ヨーロッパ腐蛆病発症時の幼虫の反応を理解するため、感染幼虫と非感染幼虫における遺伝子発現パターンをマイクロアレイ解析で比較した。その結果、感染幼虫と非感染幼虫の遺伝子発現パターンは明らかに異なり、特に、感染幼虫では、抗菌ペプチドの発現上昇と自然免疫系の活性化に重要なToll-like receptorの発現低下が起こっていることが示唆された。
４、2013年に報告された遺伝子型別法を用いて、実験使用株の遺伝子型を決定し、非典型株が海外にも存在することを示唆した。
５、M. plutoniusは、幼虫の餌であるローヤルゼリーが有する強い抗菌活性に抵抗性を示すことを明らかにした。この強い抗-抗菌活性が、本菌の経口感染成立に寄与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定していたM. plutoniusの遺伝子欠損株作出法の確立や感染幼虫のマイクロアレイ解析という目的が達成でたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度に確立したM. plutoniusの遺伝子欠損株作出法を用いて、病原性への関与が疑われる複数の遺伝子を標的に遺伝子欠損株を作出する。標的遺伝子としては、特に、菌体表層タンパク質を細胞壁に共有結合させる酵素であるソーテースの遺伝子、分泌タンパク質の遺伝子、遺伝子発現調節に関与すると考えられるレギュレーターの遺伝子などを予定している。必要に応じて、欠損させた遺伝子を再び菌に導入した相補株の作出も試みる。
また、ヨーロッパ腐蛆病を再現可能な非典型株を複数のミツバチ幼虫に経口感染させ、継時的に幼虫を採材して病理切片を作製する。その後、各切片を、HE染色、グラム染色、平成25年度に作製した抗M. plutonius血清での免疫染色など、各種染色を行うことによって、病理切片上の菌を検出し、幼虫内でのM. plutoniusの動態を明らかにする。さらに、同サンプルを電子顕微鏡でも観察し、菌の幼虫細胞内での動態など、より詳細な発病機構を解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
ミツバチの幼虫は、女王バチが盛んに卵を産む春から秋にかけての時期にしか得ることが出来ず、10月～11月以降の寒い時期には幼虫を用いた実験が出来ない。本年度は、ミツバチ幼虫内でのM. plutoniusの動態解析や感染幼虫のマイクロアレイ解析結果の確認などに使用する幼虫の採取も予定していたが、寒い時期に入り、一部の幼虫のサンプリングが遅れたため、解析に必要な試薬・消耗品類を次年度に購入することとした。
翌年度分として請求した研究費の直接経費2,800,000円（補助金1,800,000円、助成金1,000,000円）および次年度使用額120,055円の合計2,920,055円は、平成26年度に計画しているミツバチ幼虫内でのM. plutoniusの動態解析などの試験を進めるため、物品費（2,020,055円）、旅費（100,000円）、人件費（800,000円）として使用予定である。
特に、次年度繰り越し分は、物品費として、感染実験、病理解析、遺伝子解析などに必要な試薬類や消耗品類の購入に使用する予定である。
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Research Products
(1 results)
