2013 Fiscal Year Annual Research Report
精子膜マイクロドメイン局在糖鎖による新規細胞内カルシウムイオン調節機構の解明
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25292216
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
北島 健 名古屋大学, 生物機能開発利用研究センター, 教授 (80192558)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 ちひろ 名古屋大学, 生物機能開発利用研究センター, 准教授 (10343211)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 糖鎖 / 受精 / 精子 / 生理活性 / 蛋白質 / カルシウム調節 / 受精能獲得 / GPIアンカー |
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| Research Abstract |
精子マイクロドメインに局在して高度に糖鎖修飾されたGPI-アンカータンパク質（Gapglycanと総称）の普遍的存在と、そのCaイオン調節機構を解明するために、Gapglycanの哺乳類とウニ以外の生物種における普遍的存在の証明（項目1）と、Gapglycanによる細胞内Caイオン調節機構と役割の解明（項目2）を行う。項目1については、まず、Gapglycanの存在の可能性を、脊椎動物（鳥類ニワトリ、両生類アフリカツメガエル、アカハライモリ）について調査した。マイクロドメインを調製して、それを種々のレクチンを用いたレクチンブロット法によって解析して、Gapglycan候補分子を見出した。ニワトリとカエルについては、特異的なモノクローナル抗体の調製を開始して、Gapglycanに特徴的な染色像を与える抗体を調製しつつある。また、精子運動能を解析するために、ブタ、ニワトリ精子を用いて、温度コントロール下での顕微鏡観察の準備を完了した。さらに、マウスおよびラットをGapglycanの機能解析モデル系とするために、幾つかのマウス系統からマイクロドメインにおけるGapglycanの検出とそのグライコフォームの解析を行った。項目2のGapglycanと細胞内Caイオン調節機構の解明については、ブタ精子を用いてGapglycanと相互作用するCaポンプ/チャンネルの探索をCaイオン輸送体阻害剤によって行い、特定のポンプとチャンネル種が関与することをつきとめた。また、Gapglycanは受精能獲得後ではなく、それ以前の精子においてCa調節に関与することが判明した。さらに、カルシウムイメージング手法を用いて、一細胞レベルのカルシウム変化をモニターする技術の導入を行い、予備的ではあるがその観察に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
項目1のGapglycanの生物種を越えた普遍的存在証明については、平成25年度では無脊椎動物精子の入手ができなかったため調査できなかったが、脊椎動物については調査ができ、候補分子の存在を示唆することができた。また、特異的なモノクローナル抗体の調製に着手しており、さらに精子運動の観察システムのセッティングが整い、平成26年度の計画遂行に向けて順調に研究は進んでいる。項目2のGapglycanによる細胞内Caイオン調節機構の解明については、関与するCa輸送体の種類が特定でき、その特定に向けて順調に研究が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
項目1については、Gapglycanが広く動物種に存在することを証明するために、平成25年度の研究成果から、鳥類ニワトリと両生類アフリカツメガエルについて、候補分子を生化学的に精製する。また、Gapglycanに対する特異抗体の調製を完成させ、その抗体の細胞内Caイオン濃度に対する効果を調べる。平成26年度では精子からの分子の精製が重要な研究になる。また、マウスおよびラットをGapglycanの機能解析モデル系とするための準備ができたので、少量の組織と細胞でデータの取得を開始する。項目2については、ブタGapglycanと相互作用するCaポンプ/チャンネルの探索と同定を、プロテオミクス解析によるGapglycanとマイクロドメイン上で相互作用する分子の同定を行うことで実現する予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究材料として使用予定のアフリカツメガエルおよびイモリの配偶子の入手において、少なくとも2回の提供を予定していたところが、1回目の実験において､目的とする糖タンパク質の分析に予想外に多数個体が必要であることが判明した。2回目の提供のための個体数の確保と条件化に要する時間がかかり､年度内入手が困難になり、今年度にこの部分に必要な経費を使用しなかったため。
上記理由によって延期した部分の実験を､平成26年度の早い時期に遂行する。配偶子の入手後にかかる試薬、器具などの消耗品費として使用する計画である。
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