2013 Fiscal Year Annual Research Report
網羅的リン酸化タンパク質解析のための３次元電気泳動イメージング技術の構築
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25293005
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
木下 英司 広島大学, 医歯薬保健学研究院(薬), 准教授 (80304418)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | フォスタグ / リン酸化 / 翻訳後修飾 / 電気泳動 / 生物物理化学 |
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| Research Abstract |
申請者はこれまでに，リン酸基を特異的に捕捉する亜鉛錯体（フォスタグ）にアクリルアミド基を導入した誘導体を分子デバイスとして利用することで，リン酸親和性電気泳動法（フォスタグ SDS-PAGE）を開発している。本研究では，タンパク質の分離分析において活用される２次元電気泳動法を発展させ，独自に開発したフォスタグSDS-PAGEの原理を加えることで，電気泳動法における新しい３次元軸の構築を行う。これにより，深耕拡大する生体内の「リン酸化ワールドとシグナルネットワーク」を短時間（１回の電気泳動）で一網打尽に浮き彫りにするための新たな分離イメージング技術を創出する。当該年度では，リン酸化修飾と他の翻訳後修飾の同時検出を行うための３次元電気泳動解析の検証を試みた。以下に具体的な成果を記述する。
Wntシグナルの構成分子であるβ-カテニンは，プロテアソーム阻害剤存在下のHEK293細胞において，ポリユビキチン化され，１次元目の等電点電気泳動法と２次元目のSDS-PAGEで分子量の増加を検出できた。３次元目のフォスタグ SDS-PAGEを用いて展開すると，β-カテニンにはリン化酸状態の異なる少なくとも９つのリン酸化フォームが混在しており，そのうちの２つがユビキチン修飾に必須なリン酸化フォームであることが判明した。３次元展開で観察されたその２つのリン酸化フォームから分子量シフトを示す複数のスポットが派生しており，これらがユビキチン化タンパク質であることは，抗ユビキチン抗体によるウェスタン解析によって確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度においては，リン酸化修飾と他の翻訳後修飾の同時検出を視野に入れた３次元解析データを蓄積することを目標にした。IEFとSDS-PAGEを組み合わせた２次元電気泳動法よりβ-カテニンを含むスポットを同定し，それらのスポットを含むゲルを短冊状に切り出した後，フォスタグSDS-PAGEにより３次元展開することに成功した。これにより，タンパク質のリン酸化とそれに関わるユビキンチン化修飾，また，その反応プロセスを浮き彫りにすることができた。すなわち，β-カテニンにはリン化酸状態の異なる少なくとも９つのリン酸化フォームが混在しており，そのうちの２つがユビキチン化修飾に必須なリン酸化フォームであることが判明し，リン酸化がユビキチン化の分子スイッチとして機能していることを証明することができた。
このように，分子全体の翻訳後修飾の動態の同時解析が可能になることを証明できたことで，本技術の有用性を立証し，今後の展開に期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を視野に入れた３次元モニタリング法を確立する。リン酸化が関わる複合体形成など，複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能になることを証明することで，本技術の有用性を立証する。具体的には，ブルーネイティブ電気泳動（生体内の複合体を未変性で分離）とSDS-PAGE（分子量）を２次元展開の要素とし，３次元目にフォスタグSDS-PAGEを導入することも有用である。このように起点となる２次元平面ゲルを適宜応用することで，３次元電気泳動を高次複合体プロテオームのダイナミクス解析法として確立し，その有用性を立証する。同時に，分離・分解能向上のためのアクリルアミド結合型誘導体の新規合成を行い（例えば，アクリルアミド分子とフォスタ間にロングスペーサーを導入した誘導体など），改善されれば新たな分子デバイスとして顕在化させる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
消耗品費や謝金に予定していた予算が削減でき，次年度使用額が生じた。
２年目はさらに研究が展開されるので，次年度使用額1,747,637円とH26年度予算を合わせて，消耗品費や謝金に大いに活用させて頂き，研究を効率よく進める予定である。
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[Journal Article] Profiling of protein thiophosphorylation by Phos-tag affinity electrophoresis: evaluation of adenosine 5′-O-(3-thiotriphosphate) as a phosphoryl donor in protein kinase reactions.2014
Author(s)
Eiji Kinoshita, Kinoshita-Kikuta, E., Shiba, A., Edahiro, K., Inoue, Y., Yamamoto, K., Yoshida, M., and Koike, T.
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Journal Title
Proteomics
Volume: 14
Pages: 668-679
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] A Phos-tag-based magnetic-bead method for rapid and selective separation of phosphorylated biomolecules.2013
Author(s)
Tsunehiro, M., Meki, Y., Matsuoka, K., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
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Journal Title
J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci.
Volume: 925
Pages: 86-94
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Excystment-dependent alteration of protein expression in terrestrial ciliate Colpoda cucullus.2013
Author(s)
Sogame, Y., Kojima, K., Takeshita, T., Eiji Kinoshita, Funadani, R., and Matsuoka, T.
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Journal Title
Microbes Environ.
Volume: 28
Pages: 388-390
Peer Reviewed
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[Journal Article] Increase in Lipophilicity of Enalaprilat by Complexation with Copper(II) or Zinc(II) Ions.2013
Author(s)
Fujioka, H., Hieda, Y., Kuramoto, Y, Konishi, K., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike T.
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Journal Title
Yakugaku Zasshi
Volume: 33
Pages: 1135-1141
Peer Reviewed
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