2014 Fiscal Year Annual Research Report
網羅的リン酸化タンパク質解析のための３次元電気泳動イメージング技術の構築
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25293005
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
木下 英司 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 准教授 (80304418)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | フォスタグ / リン酸化 / 翻訳後修飾 / 電気泳動 / 生物物理化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者はこれまでに，リン酸基を特異的に捕捉する亜鉛錯体（フォスタグ）にアクリルアミド基を導入した誘導体を分子デバイスとして利用することで，リン酸親和性電気泳動法（フォスタグSDS-PAGE）を開発している。本研究では，タンパク質の分離分析において活用される２次元電気泳動法を発展させ，独自に開発したフォスタグSDS-PAGEの原理を加えることで，電気泳動法における新しい３次元軸の構築を行う。これにより，深耕拡大する生体内の「リン酸化ワールドとシグナルネットワーク」を短時間（1回の電気泳動）で一網打尽に浮き彫りにするための新たな分離イメージング技術を創出する。
当該年度においては，高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を視野に入れた3次元モニタリング法の確立を目指した。リン酸化が関わる複合体形成など，複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能になることを証明することで，本技術の有用性を立証した。具体的には，ブルーネイティブ電気泳動（生体内の複合体を未変性で分離）とSDS-PAGE（分子量で分離）を２次元展開の要素とし，３次元展目にフォスタグSDS-PAGEを導入することでリン酸化が関わる複合体形成など，複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能となった。
また，タンパク質を検出する際に，ウェスタンブロットにおけるフォスタグゲルからの標的タンパク質の転写効率を改善させる必要が生じた。セミドライ法では，フォスタグゲルのEDTA処理により改善された。ウェットタンク法では，通常のゲルとフォスタグゲルの差異はないが，ゲルに残存するタンパク質バンドが認められた場合，転写緩衝液に0.1% w/w SDSを添加することで，ゲルからの溶出量が増大することが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度においては，当初の予定どおり，高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を視野に入れた3次元モニタリング法の確立を目指した。その結果，リン酸化が関わる複合体形成など，複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能になることを証明することで，本技術の有用性を立証した。具体的には，ブルーネイティブ電気泳動（生体内の複合体を未変性で分離）とSDS-PAGE（分子量で分離）を２次元展開の要素とし，３次元展目にフォスタグSDS-PAGEを導入することでリン酸化が関わる複合体形成など，複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能となったので，今後の展開に期待できる。
さらには，フォスタグゲルからのタンパク質の転写効率が低い原因を明らかにし，それに基づいた改善策を確立することができた。本成果が，フォスタグSDS-PAGEを利用するすべての研究者にとって，最適な転写方法を選択するための有用なガイドラインになることが期待され，今後の展開にも活かされる。
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| Strategy for Future Research Activity |
高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を行うための3次元電気泳動解析
(この計画は前年度より持ち越されたものであり，今年度も継続して行う予定である。)
高次複合体プロテオームの質的・量的ダイナミクスの解明を視野に入れた3次元モニタリング法を確立する。リン酸化が関わる複合体形成など，複数のタンパク質分子のダイナミクスを同一ゲル内で解析が可能になることを証明することで，本技術の有用性を立証する。
次元蛍光ディファレンシャル解析法の確立
３次元蛍光ディファレンシャル解析法の確立を視野に入れたリン酸化ディファレンシャルデータを蓄積する。３次元展開ゲルにおいて，生理的・病理的状態の異なるサンプル間のリン酸化ディファレンシャル解析を行い，その検出の感度や頻度に関するデータを蓄積し，３次元蛍光ディファレンシャルイメージングの有用性を立証する。
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| Causes of Carryover |
旅費や謝金に予定していた予算が削減でき，次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
3年目はさらに研究が展開されるので，次年度使用額1,141,671円とH27年度予算を合わせて,旅費や謝金に大いに活用させていただき, 研究を効率よく進める予定である。
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[Journal Article] Profiling of protein thiophosphorylation by Phos-tag affinity electrophoresis: evaluation of adenosine 5′-O-(3-thiotriphosphate) as a phosphoryl donor in protein kinase reactions2014
Author(s)
Eiji Kinoshita, Kinoshita- Kikuta, E., Shiba, A., Edahiro, K., Inoue, Y., Yamamoto, K., Yoshida, M., and Koike, T.
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Journal Title
Proteomics
Volume: 14
Pages: 668-679
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Simple enrichment of thiol-containing biomolecules by using zinc(II)-cyclen-functionalized magnetic beads2014
Author(s)
Fujioka, H., Tsunehiro, M., Kawaguchi, M., Kuramoto, Y., Kurosaki, H., Hieda, Y., Kinoshita-Kikuta, E., Eiji Kinoshita, and Koike, T.
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Journal Title
J. Sep. Sci.
Volume: 37
Pages: 1601-1609
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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