2013 Fiscal Year Annual Research Report
硫酸抱合型尿毒症物質の肝合成阻害を機軸とする腎保護・尿毒症治療薬のシーズ創出
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25293040
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
齋藤 秀之 熊本大学, 医学部附属病院, 教授 (40225727)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
城野 博史 熊本大学, 医学部附属病院, 准教授 (40515483)
西 一彦 熊本大学, 医学部附属病院, 准教授 (30264287)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 尿毒症物質 / 腎臓病 / 代謝スクリーニング / 薬物動態 |
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| Research Abstract |
虚血性急性腎障害ラットを用い、インドキシル硫酸（IS）の産生阻害と腎機能改善効果が得られていることを検証するため、評価指標として血清中IS濃度、肝・腎組織中IS濃度、腎機能マーカーを主に検討した。血清、肝臓、腎臓中のIS蓄積量についてHPLC-MS測定し、当該阻害薬の効果について評価・判定を行った。腎結紮を30分行った虚血再灌流急性腎障害ラットを対照群、虚血再灌流（I/R）群、クレメジン（AST-120）群、resveratrol群、quercetin群及びsulforaphane群の6群に分け、0.5 w/v% 懸濁液単独（Sham）またはAST-120 (2.5 g/kg)、resveratrol (5 mg/kg)、quercetin (50 mg/kg)、sulforaphane (5 mg/kg) をそれぞれ0.5 w/v% 懸濁液で調整し、虚血再灌流24時間前、1時間前、24時間後の計3回にわたり連日経口投与した。I/R群においてSham群と比較し、血清中IS濃度が有意に上昇し、約23倍の上昇が認められた。一方、AST-120群においてI/R群と比較し、血清IS濃度が有意に減少した。また、SULT阻害薬であるresveratrol群、quercetin群においてもI/R群と比較し、血清ISの有意な減少が認められ、sulforaphane群においても同様の結果が得られた。I/R及びAST-120、SULT阻害薬、sulforaphaneを前投与することによる腎障害発現の変動を腎機能検査値において調べた。I/R群においてSham群と比較し、SCr及びBUNが有意に上昇した。一方、AST-120群及びSULT阻害薬であるresveratrol群ならびにquercetin群、またsulforaphane群においてI/R群と比較し、SCr及びBUNが有意に減少した。ポリフェノール系化合物と類似構造薬物を用い、本スクリーニング系により尿毒症物質阻害作用の比較試験を実施した。180種類の化合物 (終濃度10μM)を用い、IS産生に対する阻害効果を比較検討した結果、5種類の化合物（luteolin, esculetin, apigenin, meclofenamate, myricetin）において比較的強いIS産生阻害効果（阻害率 < 50%）が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究成果として、resveratrol、quercetin等のポリフェノール系化合物は虚血性急性腎機能障害の進展抑制効果を有すること、その機序として少なくとも一部肝臓におけるIS産生阻害作用が関与している可能性が示唆された。さらに、虚血性急性腎障害においてISが腎障害進展因子として密接に寄与すること、ISの肝産生を抑制する硫酸転移酵素阻害薬物の投与により血中並びに腎組織中のIS蓄積が低減し、腎保護効果が得られることが示唆された。従って、体内におけるIS産生経路の中で肝臓の硫酸転移酵素SULTを標的とした腎障害進展抑制及び尿毒症治療の新規機序薬物の有用性について検証することができた。ラット肝S9画分を用いたスクリーニング系を用いて探索したIS産生阻害薬物の中から、腎障害モデルラットにおいても強いIS産生阻害活性を示す薬物（resveratrol, quercetin, meclofenamate）をシーズ候補として見出すことができた。本研究成果は、次ステップへ向けたより活性の強い、かつ安全性の高い新規誘導体の探索・創出を展開するうえで有用な基盤情報となるため、本研究課題で計画する実験は概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２５年度に得られた結果を踏まえ、虚血性急性腎障害ラットにおける硫酸抱合型尿毒症物質合成阻害薬の腎保護効果の検証を実施する。in vitroスクリーニングにより選別した尿毒症物質合成阻害薬について、既に当研究室で確立した虚血再灌流急性腎障害モデルラットを用いた投与実験を行い、腎機能保護効果について比較精査する。評価の測定対象として、血清中インドキシル硫酸及びp-クレジル硫酸濃度、肝・腎組織中尿毒症物質蓄積量、腎機能マーカー、腎障害関連バイオマーカー（Kim-1、Ngal、L-FABP）、血清電解質濃度並びに腎組織中の過酸化脂質量を主に調べる。特に、尿毒症物質合成阻害薬の投与経路、投与量、投与間隔等の投与設定条件と腎保護効果との関連について詳細な検討を行う。
ヒト遺伝子導入強制発現細胞系による硫酸抱合型尿毒症物質合成モデル系を作成する。培養細胞系として肝由来HepG2、腎由来HEK293、Cos-7細胞を用い、CYP2E1、CYP2A6及び硫酸転移酵素SULT1A1の各cDNA（市販品を入手予定）を、リポフェクタミン等の遺伝子強制発現キットを用いて導入し、ヒト型尿毒症物質産生モデル細胞系を構築する。尿毒症物質合成を阻害する薬物(薬物として上述のスクリーニング法により選別された化合物を実験対象とする)について探索・評価を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
ラット肝臓画分を用いたスクリーニング系により、ポリフェノール系化合物と類似構造薬物等の尿毒症物質阻害作用の比較試験を実施した。約180種類の化合物を用い、インドキシル硫酸産生に対する阻害効果を比較検討した結果、5種類の化合物において比較的強い産生阻害効果（阻害率 < 50%）が認められた。スクリーニング系を用いて探索したインドキシル硫酸産生阻害薬物の中から、腎障害モデルラットにおいても強い阻害活性を示す薬物をシーズ候補として見出すことができた。これらのシーズ薬物の情報等をもとに、より強いインドキシル硫酸産生阻害活性を示す薬物のスクリーニング並びに細胞毒性等の検証試験を計画していたが、時間的制約等のため次年度に継続して実施することとなった。
平成２５年度の研究成果を踏まえ、既に確立したインドキシル硫酸産生系を用いたin vitroスクリーニング法を活用し、共同研究提携企業が保有する化合物ライブラリから定性的・定量的に阻害活性の強い化合物を探索することで尿毒症物質合成阻害のシーズとなる候補薬物の選定を展開する。尿毒症物質合成阻害薬について、虚血再灌流急性腎障害ラットを用いた投与実験を行い、腎機能保護効果について比較精査する。評価の測定対象として、血清中インドキシル硫酸、肝・腎組織中尿毒症物質蓄積量、腎機能マーカー、腎障害関連バイオマーカー、血清電解質濃度並びに腎組織中の過酸化脂質量、酸化ストレスのマーカーを主に調べる。インドキシル硫酸の蓄積に伴う酸化ストレス発生を定量的に評価するため、活性酸素・フリーラジカル自動分析装置を購入する。
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[Journal Article] Effects of atrial natriuretic Peptide on bicarbonate transport in long- and short-looped medullary thick ascending limbs of rats.2013
Author(s)
Nonoguchi H, Izumi Y, Nakayama Y, Matsuzaki T, Yasuoka Y, Inoue T, Inoue H, Mouri T, Kawahara K, Saito H, Tomita K.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 8
Pages: e83146
DOI
Peer Reviewed
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