2016 Fiscal Year Annual Research Report
Study for mechanism of ABC transporters based on single molecular direct observations using high speed Atomic Force Microscopy.
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25293049
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
相馬 義郎 慶應義塾大学, 医学部, 准教授 (60268183)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ABCトランスポ－タ－ / ATP加水分解 / NBDドメイン / 膜輸送 / 分子間相互作用 / 抗原抗体反応 / 原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）日本で見つかっている病因性CFTR変異体のうち、特に頻度が高くホモ患者も確認されている医学的に重要な massive deletion 変異体である(G970-T1122)del-CFTRのHEK細胞を用いた大量発現・精製法を確立した。TEMによる初期観察では、(G970-T1122)del-CFTRの小さい粒子が2個連なるような形状の良好な粒子像が得られた。今後は、蛋白純度を、高速AFMによる直接観察に使えるレベルにまで上げ、動態観察を行なう予定でいる。
２）CFTRのPKA依存性活性調節は、Rドメインに複数存在するPKAリン酸化コンセンサスサイトのリン酸化によって調節されている。これらのリン酸化サイト中のセリン残基を、様々な組み合わせでグルタミン酸 (StoE)もしくはアスパラギン酸 (StoD)に変異させてセリン残基のリン酸化状態を模擬することにより恒常的に活性化状態にあるCFTR変異体を複数種作成すること成功した。この恒常的活性化CFTR変異体は、CFTRの生体内での活性調節において中心的な役割を果たしているRドメインの高速AFMによる直接観察による動態研究の試料に最適である。これらの変異体の発現レベルは野生型より低いものが多いが、現行のHEK細胞発現・精製系の改良に加え、バキュロおよび無細胞発現系の導入も視野に入れても、高純度精製法の確立を目指している。
３）当該研究の初年度・第2年度に得られた、WT-CFTRの可溶化および人工脂質膜組込み時の１分子動態観察データの追試・確認および追加実験を行なった。現在、論文執筆の最終段階にある。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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