神経変性疾患発症に関与するＰＫＣリン酸化基質タンパク質の同定と創薬への応用

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25293060
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 齋藤 尚亮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (60178499)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 足立 直子 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助教 (70604510) ; 上山 健彦 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 准教授 (80346254)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: プロテインキナーゼC / パーキンソン病 / モデルマウス / 質量分析 / ドーパミン

Outline of Annual Research Achievements

プロテインキナーゼCg(PKCg) のナンセンス変異を持つAS/AGUラットはパーキンソン症状を呈する。我々は、AS/AGUラットがPKCノックアウト(KO)であること、PKCgKOマウスが線条体ドパミン(DA)放出や黒質DA神経細胞変性などのパーキンソン症状を呈することを示したことから、我々はPKCgKOマウスがパーキンソン病のモデルになることを提唱した。しかしながら、PKCgKOマウスは、黒質線条体系以外でも多くの神経情報伝達機構の異常をもたらしているため、PKCgKOマウスをパーキンソン病のモデルとして、薬物スクリーニングに使用することには問題があった。そこで、黒質線条体のPKCgの基質がリン酸化されなくなることがパーキンソン症状の原因であるという仮説を考え、PKCgKOと野生型(WT)のマウス線条体を用い、PKCgの基質の同定を目的として、リン酸化プロテオーム解析を行った。
Ion intensityを用いた半定量的解析により、PKCリン酸化モチーフを持つ９個のタンパクを同定した。昨年度着目して検討を行ったbPIXに加え、本年度はConnexin43, MADD, CSPa, Calnexin, Stathmin, NogoA, a-adducin, b-adducinについて、検討を行った。まず、dopamine遊離に対する各タンパク質のノックダウンの効果を調べたところ、MADD, CSPa, Calnexin, a-adducinはdopamine遊離に促進的に作用していることが明らかとなった。また、PKCgによるin vitro, in vivoでのリン酸化実験により、CSPaとa-adducinが、パーキンソン症状を引き起こすPKCgのリン酸化基質タンパク質として可能性があることが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初、着目する分子として、bPIX、 CSPa、MADDの3分子を挙げたが、それら以外にも、Connexin43, Calnexin, Stathmin, NogoA, a-adducin, b-adducinについても検討し、a-adducinが新しくPKCgの基質タンパク質として、パーキンソン症状の発症に関与している可能性を示すことができた。また、bPIXの結果を論文としてまとめ、J. Neurosci誌に掲載された。。

Strategy for Future Research Activity

bPIX, a-adducin, CSPa変異体のノックインマウスを作製する。つまり、本年度明らかになったPKCgによるリン酸化部位に変異を導入したノックインマウスを作製し、PKCgによるリン酸化の消失により、パーキンソン様症状を示すか否かを検討する。これにより、全く新しい、パーキンソン病モデルマウスの作製を試みる。

Causes of Carryover

遺伝子組み換えマウス（モデルマウス）作製よりも、bPIX以外の他のリン酸化基質候補のスクリーニングを優先したため、マウスの作製に取り掛からず、そのための経費が掛からなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

複数種のモデルマウス（変異導入マウス）を作製することを予定しており、より多くの物品費が必要になると予想される。本年度使用しなかった物品費を次年度に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] The Extracellular A-loop of Dual Oxidases Affects the Specificity of Reactive Oxygen Species Release. (2015)
  • Author(s): Ueyama T, Sakuma M, Ninoyu Y, Hamada T, Dupuy C, Geiszt M, Leto TL, Saito N.
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 290 Pages: 6495-6506
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.592717.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification and characterization of PKCγ, a kinase associated with SCA14, as an amyloidogenic protein. (2015)
  • Author(s): Takahashi H, Adachi N, Shirafuji T, Danno S, Ueyama T, Vendruscolo M, Shuvaev AN, Sugimoto T, Seki T, Hamada D, Irie K, Hirai H, Sakai N, *Saito N.
  • Journal Title: Hum Mol Genet. Volume: 24 Pages: 525-539
  • DOI: 10.1093/hmg/ddu472
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The role of Pak-interacting exchange factor-β phosphorylation at serines 340 and 583 by PKCγ in dopamine release. (2014)
  • Author(s): Shirafuji T, Ueyama T, Yoshino K, Takahashi H, Adachi N, Ago Y, Koda K, Nashida T, Hiramatsu N, Matsuda T, Toda T, Sakai N, Saito N.
  • Journal Title: J Neurosci. Volume: 34 Pages: 9268-9280
  • DOI: 10.1523/JNEUROSCI.4278-13.2014
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Maintenance of stereocilia and apical junctional complexes by Cdc42 in cochlear hair cells. (2014)
  • Author(s): Ueyama T, Sakaguchi H, Nakamura T, Goto A, Morioka S, Shimizu A, Nakao K, Hishikawa Y, Ninoyu Y, Kassai H, Suetsugu S, Koji T, Fritzsch B, Yonemura S, Hisa Y, Matsuda M, Aiba A, Saito N.
  • Journal Title: J Cell Sci. Volume: 127 Pages: 2040-2052
  • DOI: 10.1242/jcs.143602.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Heparin inhibits melanosome uptake and inflammatory response coupled with phagocytosis through blocking PI3k/Akt and MEK/ERK signaling pathways in human epidermal keratinocytes. (2014)
  • Author(s): Makino-Okamura C, Niki Y, Takeuchi S, Nishigori C, Declercq L, Yaroch DB, Saito N.
  • Journal Title: Pigment Cell Melanoma Res. Volume: 27 Pages: 1063-1074
  • DOI: 10.1111/pcmr.12287.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] RANTES/CCL5 mediated-biological effects depend on the syndecan-4/PKCa signaling pathway (2014)
  • Author(s): Maillard, L., Saito, N., Hlawaty, H., Friand, V., Suffee, N., Chmilewsky, F., Haddad, O., Laguillier, C., Guyot, E., Ueyama, T., Oudar, O., Sutton, A., Charnaux, N.
  • Journal Title: Biology Open Volume: 3 Pages: 995-1004
  • DOI: 10.1242/bio.20148227
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Both the C1 domain and a basic amino acid cluster at C-terminus are important for neurite and branch induction ability of DGK. (2014)
  • Author(s): Takuya Kano, Takeshi Kouzuki, Satoru Mizuno, Shuji Ueda, Minoru Yamanoue, Fumio Sakane, Naoaki Saito and Yasuhito Shirai
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun, Volume: 447 Pages: 89-94
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.03.113.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Diacylglycerol kinase gamma regulates antigen-induced mast cell degranulation by mediating Ca2+ influxes (2014)
  • Author(s): Sakuma, M., Shirai, Y., Ueyama, T., and Saito, N.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun, Volume: 445 Pages: 340-345
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.01.197
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Cdc42 is required for maintenance of stereocilia and apical junctional complexes in cochlear hair cells. (2014)
  • Author(s): Ueyama, T., Sakaguchi, H., Goto, A., Hisa, Y., Matsuda, M., Aiba, A. and Saito, N.
  • Organizer: The 37th Naito Conference
  • Place of Presentation: 北海道ニセコ
  • Year and Date: 2014-07-15 – 2014-07-18