2014 Fiscal Year Annual Research Report
アミロイドーシス発症を促進・抑制する生体分子環境解明：試験管実験と動物実験の統合
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25293094
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
内木 宏延 福井大学, 医学部, 教授 (10227704)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
樋口 京一 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20173156)
長谷川 一浩 福井大学, 医学部, 助教 (60324159)
小澤 大作 福井大学, テニュアトラック推進本部, 助教 (60554524)
大越 忠和 福井大学, 医学部, 助教 (90362037)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | アミロイドーシス / アミロイド線維 / β2-ミクログロブリン / 細胞外シャペロン / 血清アミロイドP成分 / C反応性蛋白質 / 細胞傷害 / トランスジェニックマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、β2-ミクログロブリン (β2-m) アミロイドーシス発症の分子機構を総合的に解明する。具体的には、１．種々の生体分子がβ2-mアミロイド線維形成を促進・抑制する分子機構、特に細胞外シャペロンのβ2-m線維形成抑制機構を解明すること、２．β2-m線維による細胞・組織傷害機構を解明すること、３．β2-m線維形成・沈着を阻害する有機化合物を探索すること、４．ヒトアミロイドーシスに共通する発症機構や治療戦略と共に、アミロイド沈着の臓器特異性を説明する作業モデルを提案すること、の４点を目的とする。
１．に関し、新たに発見した細胞外シャペロンである血清アミロイドP成分（SAP）とC反応性蛋白質（CRP）が、D76N β2-mモノマー～オリゴマーに結合し、中性pHにおけるアミロイド線維形成をCaイオン非依存性に抑制すること、および一旦アミロイド線維が形成され始めると、SAPがCaイオン依存性にアミロイド線維に結合し、線維形成を促進することを明らかにした。SAPに関するこれらのデータは、同分子のA面がアミロイド線維形成を抑制する一方、B面が線維形成を促進することを単一の実験系で示した初めての研究であり、SAPの機能解明に大きく貢献すると考えられる。
２．に関し、野生型β2-mアミロイド線維が、ウサギ滑膜線維芽細胞内に取り込まれた後、エンドソーム膜、リソソーム膜の破壊を介し、壊死及びアポトーシスの両者を引き起こすことを明らかにした。これらのデータは、アミロイド線維の新規細胞傷害機構を示しており、アミロイドーシス全般の病態解明に大きく貢献すると考えられる。
１～４の全てに関わるD76N β2-mトランスジェニックマウスの作成は間もなく完了し、今後同マウスを繁殖させ、アミロイド沈着の加齢変化や臓器分布を、既に作成した野生型β2-m TGマウスと比較しながら解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、１．蛋白質科学的手法を用いた試験管内実験、２．細胞培養実験、および３．トランスジェニックマウスを用いた動物実験より成り、それぞれの実験で得られたデータを統合することにより、ヒトアミロイドーシスに共通する発症機構や治療戦略と共に、アミロイド沈着の臓器特異性を説明する作業モデルを提案することを目指している。
１．に関しては順調に進展し、新たに発見した細胞外シャペロンである血清アミロイドP成分（SAP）とC反応性蛋白質（CRP）が、D76N β2-mモノマー～オリゴマーに結合し、中性pHにおけるアミロイド線維形成をCaイオン非依存性に抑制すること、および一旦アミロイド線維が形成され始めると、SAPがCaイオン依存性にアミロイド線維に結合し、線維形成を促進することを明らかにした。SAPに関するこれらのデータは、同分子のA面がアミロイド線維形成を抑制する一方、B面が線維形成を促進することを単一の実験系で示した初めての研究であり、SAPの機能解明に大きく貢献すると考えられる。
２．に関しても順調に進展し、野生型β2-mアミロイド線維が、ウサギ滑膜線維芽細胞内に取り込まれた後、エンドソーム膜、リソソーム膜の破壊を介し、壊死及びアポトーシスの両者を引き起こすことを明らかにした。これらのデータは、アミロイド線維の新規細胞傷害機構を示しており、アミロイドーシス全般の病態解明に大きく貢献すると考えられる。
３．に関しては当初計画よりやや遅れており、D76N β2-mトランスジェニックマウスの作成は間もなく完了する予定である。今後同マウスの繁殖を急ぎ、アミロイド沈着の加齢変化や臓器分布を、既に作成した野生型β2-m TGマウスと比較しながら解析する。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．新規細胞外シャペロンの探索とアミロイド線維形成抑制機構解析：新たに発見した細胞外シャペロンである血清アミロイドP成分（SAP）とC反応性蛋白質（CRP）のアミロイド線維形成抑制・修飾機構の全貌を、D76N β2-mの線維形成反応系を使い蛋白質科学的に解明する。
２．ヒト変異型D76N β2-mトランスジェニック（TG）マウスの作成とアミロイド沈着の評価：間もなく作成の完了するD76N β2-m TGマウスを繁殖させ、アミロイド沈着の加齢変化や臓器分布を、既に作成した野生型β2-m TGマウスと比較しながら、病理組織学的に解析する。
３．野生型β2-mアミロイド線維の細胞傷害機構、および炎症惹起機構の解析：β2-mアミロイド線維の培養滑膜線維芽細胞傷害機構の全貌を、ネクローシス経路およびアポトーシス経路の両方に注目して解析すると共に、プロテアーゼや炎症性サイトカインの発現・分泌を、RT-PCR法等を用いて解析する。
４．野生型およびD76N β2-mアミロイド線維形成を促進する生体分子群の探索：リゾリン脂質を始めとする脂質やプロテオグリカンなどの細胞外マトリクス分子の線維形成促進機構を、野生型およびD76N β2-mの線維形成反応系を使い蛋白質科学的に解明する。
５．データの統合、モデルの構築：上記データを統合し、β2-mアミロイド線維形成、および野生型・変異型β2-mそれぞれの臓器特異的沈着の分子機構を統一的に説明するモデルを構築、同時に治療戦略を提案する。
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| Causes of Carryover |
試験管内実験で使用したSAP及びCRPは、当初市販品を購入していたが、平成26年9月、ロンドン大学Centre for Amyloidosis and Acute Phase ProteinsのSir Pepys教授よりSAP及びCRPの供与を受けたため、当初予算が310,849円余り、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
クロマトグラフィー解析に必要な消耗品であるカラムを新規に購入するなどして、新年度出来るだけ早期に使用する予定である。
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Research Products
(8 results)
