2014 Fiscal Year Annual Research Report
マラリア原虫の赤血球侵入時におけるシグナル伝達経路の解明
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25293102
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
金子 修 長崎大学, 熱帯医学研究所, 教授 (50325370)
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2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 原虫 / 侵入 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マラリア原虫の赤血球侵入は宿主体内では必須のステップである。赤血球表面に接着した原虫は、細胞内小器官から種々の分子を秩序だって分泌しながら赤血球に侵入する。ところが、これらの細胞内小器官からの分子分泌に関するシグナル伝達経路は断片的にしかわかっていない。そのため、本研究では、新規コンディショナル・ノックダウン/アウト系により、赤血球侵入期に発現している原虫分子をノックダウン/アウトした組換えネズミマラリア原虫を網羅的に作製し、細胞内小器官からの分子分泌やCa 濃度の変化等を指標に、各細胞内小器官の分泌調節機序のシグナル伝達経路を明らかにすることで、ワクチンや薬剤開発の標的を見出す事を目的とする。
平成25年度に入手したTet発現誘導系によりprf遺伝子の遺伝子発現が抑制される遺伝子組換えP. bergheiでは,我々の手でもTet-OFFが作動することが確認できたため、我々の手技が問題ではないことが明らかとなった。そこで、本組換え体の作製に使用されたプラスミドを基にして、新たにプラスミドをデザインしなおし、Tet投与にてmCherry発現が抑制される遺伝子組換えP. yoeliiを作製した。作製した組換え体を解析したところ、Tet-OFFが作動することが確認できた。続いてTet-OFFをTet-ONに改変し、Tet投与にてmCherryが発現される遺伝子組換えP. yoeliiを作製し、Tet-ONの系も作動することを確認した。さらに、作製したTet-ONの系により部位特異的組換え酵素を発現する遺伝子組換えP. yoeliiを作出し、昨年度に解析を試みたmsp8およびebl遺伝子座を標的にして、Tet-ONにより標的遺伝子座破壊が誘導されるプラスミドの調整を開始した。また、P. yoeliiの赤血球侵入過程をモニターする系を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ネズミマラリア原虫P. bergheiで作動したと報告されたTet発現誘導系が、ネズミマラリア原虫P. yoeliiで作動が確認できず、原因を明らかにするのに時間がとられた。昨年度に問題を解決したので、全体としては進行がやや遅れているが、現在は研究は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度はTet 発現誘導系とCre/loxP 部位特異的組換え法により標的遺伝子座をゲノムから完全に除去する方法を組み合わせて、標的タンパク質を全く発現しない原虫を作製する手法を確立する。Tetによる発現誘導系ができ次第、熱帯熱マラリア原虫赤血球侵入型原虫の網羅的転写解析により赤血球侵入期に発現する事が分かっている分子のP. yoelii相同体を約100分子選択し、コンディショナル・ノックアウト用プラスミドの構築を行う。構築したプラスミドをネズミマラリア原虫に遺伝子導入し、組換え原虫を作製する。得られた組換え原虫を用いて標的遺伝子の発現をノックアウトし、増殖率の低下を指標にスクリーニングし、増殖に関与する分子すなわち侵入効率が減少していると考えられる原虫を選択する。侵入効率が減少した原虫について、各分子の発育・赤血球侵入で作用するステップを明らかにし、そのステップが細胞内Ca 濃度が変化する以前か以後か、また、マイクロネームやロプトリー分子の分泌の以前か以後かを明らかにし、赤血球侵入に必須である分子群を分類し、機能と関連付ける。
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| Causes of Carryover |
初年度に予定していたTet発現誘導系の確立に時間がかかり、平成26年に予定していた遺伝子導入用プラスミドと遺伝子改変原虫の作製、それらの解析を平成27年以降に行うこととしたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
多数の遺伝子導入用プラスミドと遺伝子改変原虫の作製、それらの解析をするための消耗品として使用する。
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