2013 Fiscal Year Annual Research Report
マウス腸炎モデルを用いたサルモネラ炎症制御機構の解析
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25293106
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
岡田 信彦 北里大学, 薬学部, 教授 (80194364)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
羽田 健 北里大学, 薬学部, 講師 (00348591)
守屋 智草 北里大学, 薬学部, 助教 (90518101)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | サルモネラ / 腸管感染モデル / 腸炎 / III型分泌機構 / III型エフェクター |
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| Research Abstract |
サルモネラ (Salmonella enterica) は初期感染の場である腸管粘膜において、炎症反応を誘導し、その後全身感染へと進んでいく。本菌の感染現象を解明する上で､サルモネラIII型分泌機構およびその分泌タンパク質（III型エフェクター）が、極めて重要な因子である。本研究では、サルモネラのIII型エフェクターにより制御される宿主の免疫応答について､マウス腸管感染モデルを用いて解析し、サルモネラ初期感染過程における炎症応答制御機構を明らかにすることを目的とし、本年度は、サルモネラの炎症誘導および炎症抑制に関わるIII型エフェクターを介した感染宿主との相互作用に焦点を絞り、解析を行った。
まず、サルモネラ炎症制御エフェクターの同定のために、SPI1エフェクター11個、SPI2エフェクター17個およびSPI1/2エフェクター10個、をそれぞれ発現する哺乳動物発現ベクターを作成した。各プラスミドDNAをHeLa 細胞、RAW264.7細胞およびDC2.4細胞に形質転換し、細胞内での発現を確認した。いくつかのIII型エフェクターは、形質転換後、細胞死を誘導することを見いだした。また、培養細胞内での発現量が低いエフェクターについては、大腸菌での発現を確認する予定である。今後、形質転換体に対するサルモネラ野生株の感染でサイトカインの産生量を比較することで、炎症抑制型のエフェクターの同定を行う。
炎症抑制型エフェクターとして同定したSseK1、SseK2およびSseK3による炎症抑制機構は、Ssek1およびSseK3において、TNF-α経路刺激によるNF-κBの活性化を抑制していることを明らかにした。一方、IL-1およびPKC経路における抑制は全くみられなかったことから、現在、Ssek1と相互作用するTNF-α経路に関わる宿主因子の同定を、GSTおよびFLAG pull-down法で進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
サルモネラIII型エフェクターのクローニングおよび培養細胞内での発現確認を行うところでやや時間がかかったため、炎症抑制型エフェクターの同定までは進めることはできなかったが、既知のエフェクターについてはすべて発現プラスミドを作成したことから、今後の実験の進行は速やかに進めることが可能である。また、一部すでに炎症抑制型エフェクターであるSseKについては、その機能および関連する宿主因子の同定実験を開始し、おおむね順調に進んでいる。また、実験プロトコールを確立したことで、今後、新たに抑制型エフェクターとして同定されるサルモネラIII型エフェクターについても速やかに実験を進めることが可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度に作成したIII型エフェクター発現プラスミドの形質転換細胞へのサルモネラ野生株感染によりサイトカイン（HeLa細胞ではIL-8、RAW264.7細胞ではIL-1β）の発現を指標に分泌抑制をするIII型エフェクターを同定する。一方で、マウス腸管感染モデルにおいて､SPI-1III型エフェクターおよびSPI-2III型エフェクターの腸管炎症誘起に関わる役割を明らかにする必要がある。そのために、野生株、SPI-1変異株、SPI-2変異株およびSPI-1SPI-2二重変異株を用いた腸管感染での病理学的解析、感染マウスの盲腸組織を用いたトランスクリプトーム解析および免疫学的解析を行うことで、SPI-1およびSPI-2から分泌されるそれぞれのIII型エフェクターが担う炎症誘導および炎症抑制の役割を類推する。この基礎データをもとに、炎症抑制型III型エフェクターの遺伝子欠失株によるマウス腸管感染の病理学的および免疫学的解析を推し進めていく。
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