2013 Fiscal Year Annual Research Report
再生腸上皮幹細胞ニッチの誘導・再構築による炎症腸管粘膜再生治療の確立
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25293170
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
岡本 隆一 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 寄附講座准教授 (50451935)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 哲也 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 寄附講座准教授 (70265809)
土屋 輝一郎 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 寄附講座准教授 (40376786)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 腸管上皮 / 炎症性腸疾患 / Notchシグナル / オルガノイド / ニッチ |
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| Research Abstract |
①腸管上皮陰窩-絨毛軸におけるDll1及びDll4陽性細胞同定法の開発：1) NotchリガンドであるDll1及びDll4を発現する細胞を正確かつ簡便に同定する検出法を新たに開発した。同方法により、両分子を発現する腸管上皮細胞を組織内に於いて単一細胞レベルで正確に同定可能となった。同法により、正常腸管内陰窩における両分子発現細胞がATOH1陽性の分泌型細胞で構成される異なる細胞分画であり、いずれもHes1陽性細胞と隣接して存在していた。2) Dll1, Dll4陽性細胞はいずれもc-kit陽性の大腸幹細胞ニッチ構成細胞に発現していた。3) デキストラン硫酸（DSS）大腸炎モデルの病変部に於いてDll1陽性大腸上皮細胞が著しく減少する一方、Dll4陽性大腸上皮細胞が著しく増加するだけでなく、これらDll4陽性大腸上皮細胞の増加に伴い、隣接するHes1陽性細胞の増加も明らかとなった。これら結果より、Dll1及びDll4は大腸幹細胞ニッチ構成細胞に発現し、かつ大腸炎粘膜においてはDll4陽性細胞がより重要な役割を担っている可能性を明らかとした。
②腸管上皮幹細胞ニッチにおけるDll1及びDll4陽性細胞の機能的意義の解析：1) LGR5-EGFP-CreERT2マウス及びATOH1-CrePGRマウスを用い、幹細胞又は分泌型細胞特異的にDll1及びDll4の欠損を誘導可能なマウスを作成し、その表現型を解析した。その結果、両リガンドの欠損により分泌型上皮が著しく増加する一方、増殖マーカー陽性の細胞が著しく減少する事が明らかとなった。2) 上記に加え、幹細胞に隣接するニッチ構成細胞で両リガンドが欠損すると、LGR5の発現が減弱する事が明らかとなった。これらの結果から、腸管上皮幹細胞ニッチにおいて、Dll1及びDll4が重要な機能的意義を有していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画に則り、大腸炎粘膜におけるDll1及びDll4の発現局在を同定する手法を開発し、大腸炎粘膜における動態解析を実施した。その結果、Dll1とDll4が異なる上皮細胞分画に発現し、かつ各々が幹細胞を維持するニッチ構造に於いてリガンドとして機能している可能性を明確に示し、報告した。また大腸炎粘膜に於いては、正常大腸粘膜と比べ両分子の発現パターンは大きく異なり、Dll1に比してDll4の発現が著しく優位となることから、Dll4がより独占的な役割を担っている可能性を示すことに成功している。さらに、当初計画されていた遺伝子改変マウス等を用いることにより、生体内幹細胞ニッチ構造におけるDll1及びDll4の機能的意義を解析する系の構築に既に成功している。同系の構築により、両リガンドによるNotch活性化が腸管上皮幹細胞ニッチの重要な機能的構成要素であることを生体内表現型として追跡可能であるのみならず、これらを体外でオルガノイドとして培養し、LGR5-EGFPを指標として幹細胞の動態とin vitroで経時的に追跡することが可能となっている。同in vitro培養系を用い複数の化合物が幹細胞ニッチ維持に与え得る表現型評価系の構築も順調に推移しており、従って本研究はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初計画に則り、大腸炎粘膜におけるDll1及びDll4の発現局在を同定する手法を開発し、大腸炎粘膜における動態解析を実施した。その結果、Dll1とDll4が異なる上皮細胞分画に発現し、かつ各々が幹細胞を維持するニッチ構造に於いてリガンドとして機能している可能性を明確に示し、報告した。また大腸炎粘膜に於いては、正常大腸粘膜と比べ両分子の発現パターンは大きく異なり、Dll1に比してDll4の発現が著しく優位となることから、Dll4がより独占的な役割を担っている可能性を示すことに成功している。さらに、当初計画されていた遺伝子改変マウス等を用いることにより、生体内幹細胞ニッチ構造におけるDll1及びDll4の機能的意義を解析する系の構築に既に成功している。同系の構築により、両リガンドによるNotch活性化が腸管上皮幹細胞ニッチの重要な機能的構成要素であることを生体内表現型として追跡可能であるのみならず、これらを体外でオルガノイドとして培養し、LGR5-EGFPを指標として幹細胞の動態とin vitroで経時的に追跡することが可能となっている。同in vitro培養系を用い複数の化合物が幹細胞ニッチ維持に与え得る表現型評価系の構築も順調に推移しており、従って本研究はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度末時点で、当該年度の機器保守契約費用の支払が完了していない為。
また、試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。
平成25年度の機器保守契約費用の支払に充当する。
また、検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。
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[Journal Article] Myosin light chain kinase expression induced via tumor necrosis factor receptor 2 signaling in the epithelial cells regulates the development of colitis-associated carcinogenesis.2014
Author(s)
M. Suzuki, T. Nagaishi, M. Yamazaki, M. Onizawa, T.Watabe, Y. Sakamaki, S.Ichinose, M. Totsuka, S. Oshima, R. Okamoto, M. Shimonaka, H. Yagita, T. Nakamura, M. Watanabe.
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Journal Title
PLoS ONE
Volume: 9
Pages: e88369 -e88369
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Distinct expression patterns of Notch ligands, Dll1 and Dll4, in normal and inflamed mice intestine.2014
Author(s)
Shimizu H, Okamoto R, Ito G, Nakata T, Suzuki K, Murano T, Mizutani T, Tsuchiya K, Nakamura T, Hozumi K, Watanabe M.
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Journal Title
PeerJ
Volume: 2
Pages: e370
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Hes1 promotes the IL-22-mediated antimicrobial response by enhancing STAT3-dependent transcription in human intestinal epithelial cells2014
Author(s)
Murano T, Ito G, Nakata T, Hibiya S, Shimizu H, Fujii S, Kano Y, MizutaniT, Yui S, Akiyama-Morio J, Nemoto Y, Tsuchiya K, Nakamura T, Watanabe M.
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun
Volume: 17
Pages: 840-846
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Lineage-specific expression of Bestrophin-2 and Bestrophin-4 in human intestinal epithelial cells2013
Author(s)
Ito G, Okamoto R, Murano T, Shimizu H, Fujii S, Nakata T, Mizutani T, Yui S, Akiyama-Morio J, Nemoto Y, Okada E, Araki A, Ohtsuka K, Tsuchiya K, Nakamura T, Watanabe M.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 8
Pages: e79693
DOI
Peer Reviewed
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