2013 Fiscal Year Annual Research Report
細胞周期標識・放射線感受性小頭症遺伝子欠損マウスを用いた関連分子の動態・機能解析
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25293240
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
伊東 恭子 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80243301)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伏木 信次 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80150572)
藤森 亮 独立行政法人放射線医学総合研究所, 放射線防護研究センター・リスク低減化研究プログラム・感受性モデル動物研究チーム, チームリーダー (50314183)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 先天異常学 / 小頭症 / 細胞周期 |
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| Research Abstract |
1. 条件的Aspm欠損マウスの作製
① 2系統のFucciトランスジェニックマウス（理研バイオリソースセンターより提供）、即ちG1期の核が赤色の蛍光を発するトランスジェニック(TG)マウスC57BL/6J.Jcl.Cg-TgFucci596Bsi(mKO)、S/G2/M期の核が緑色の蛍光を発するTGマウスC57BL/6J.Jcl.Cg-TgFucci504Bsi(mAG/mAG)を交配し、ホモ化したFucciダブルTGマウス:C57BL/6J.Jcl.Cg-DTg Fucci504Bsi(mAG/mAG)596Bsi(mKO)を作製した。
② 共同研究者により、既に作製されているC57BL/6J.Jcl-Aspmtm1(flox)Nrs flox/floxマウスとNestinプロモータ下にCreERT2を発現するTgNes-CreERT2マウスを交配し、タモキシフェン誘導により、発生期の中枢神経系特異的にAspm遺伝子を欠損するマウス系統C57BL/6J.Jcl-Aspmtm1(flox)Nrsflox/flox,Tg(Nes-CreERT2)を作製した。
③ FucciダブルTGマウスとC57BL/6J.Jcl-Aspmtm1(flox)Nrsflox/flox,Tg(Nes-CreERT2)を交配することにより、タモキシフェン誘導型Aspm遺伝子破壊マウスで、かつ脳室層・脳室下層における増殖細胞の細胞周期を観察できる条件的Aspm欠損マウスC57BL/6J.Jcl-Aspmtm1(flox)Nrsflox/flox,Tg(Nes-CreERT2),Fucci504Bsi(mAG/mAG)596Bsi(mKO)：Fucci-CreERT2-Aspmfloxと呼ぶ) が作製できた。平成26年度以降、当該遺伝子改変マウスを用いて、胎仔期の脳形成過程を詳細に検索する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時の計画書通りに、遺伝子改変マウスの作製が順調に進められた。今後、タモキシフェン投与条件を決定し、胎仔脳の解析を進める予定である。
また、平成27年度に予定していた出生後成マウスの行動実験に関しては予備実験が進行しており、総合的に順調な進捗状況であると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
① タモキシフェン(以下、TAM)投与によるAspm遺伝子破壊条件の設定：当該マウスを対象に胎齢8.5日、9.5日、10.5日の母体にTAM 0.12m/g体重を1回経管投与し、胎齢11.5日～17.5日まで1日毎に胎仔を取り出し終脳の形成を解析する。脳室層、脳室下層におけるG1期、S/G2/M期の細胞動態を観察する。この実験によって、皮質板形成の始まるどの時期にAspm遺伝子を失うと細胞増殖、分化に変化がもたらされるかを明らかにする。
② タイムラプスによる細胞周期解析：TAM投与後、胎齢13.5日に取り出した胎仔終脳壁の組織培養を行い、共焦点レーザ顕微鏡下、タイムラプスで一細胞レベルにおけるG1期、S/G2/M期の移行を24時間～48時間観察する。細胞周期、対称性、非対称性分裂の動態に関して解析する。
③ 細胞分化・移動に着目した脳形成解析：TAM投与後にBromodeoxyuridine (BrdU) を腹腔内投与してS期のDNA合成細胞を標識する。その2-3日後に胎仔脳を取出し、BrdU標識細胞の分化・移動状態、Fucci標識細胞の挙動から、細胞分化・細胞移動に対するAspm遺伝子欠損の影響を解析する。
④ 生後マウスにおける脳形成解析：MRI画像(T2強調、拡散テンソル画像)を用いて、大脳皮質、海馬、脳室容積、神経回路の経時的な変化をとらえ、同時に組織学的解析を加え、Aspmの機能が脳の発生段階を追ってどのように変化するか、その成熟脳での帰結を明らかにする。
⑤ 成マウスを対象とした学習・行動解析：当該成マウスを用いて、自動制御・24時間モニタリングとRFタグでの個体認識により、集団生活環境下での社会行動・空間認知機能解析を可能にするIntelliCageを用いた行動実験を行う。この一連の解析によって、完成した脳機能に及ぼすAspm欠損の影響を明らかにすることができる。
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