プロテオーム解析による五十肩の病態解明と新規治療・診断法の開発

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25293315
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 萩原 嘉廣 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90436139)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西條 芳文 東北大学, 医工学研究科, 教授 (00292277) ; 土谷 昌広 東北大学, 歯学研究科, 助教 (60372322) ; 森 大 慶應義塾大学, 先端生命科学研究所, 助教 (00588981)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 凍結肩 / プロテオーム解析 / 抽出法 / 組織破壊法

Research Abstract

凍結肩から得られる関節包サンプルは固いため、関節包から安定したタンパク抽出のための組織破壊法を検討した（実験１．ホモジェンートのストローク回数：50、100、200、400、800回、実験２．Lysis bufferの違い：8M Urea in 100mM TEAB(pH 8.5), 12mM SDC 12mM SDDS in 100mM TEAB(pH 8.5))。実験1では各ストローク数でほぼ安定したタンパク抽出が行えており、ストローク数を100回と設定した。実験2では、12mM SDC 12mM SDDS in 100mM TEAB(pH 8.5)の方がより多くのタンパク抽出が可能で、再現性が高かった。
サンプルは下肩甲上腕関節靭帯から採取した。凍結肩：4サンプル、コントロール（関節可動域制限のない腱板断裂）：4サンプルで行った。実施内容は①組織破壊（SDCとSDDSを利用してホモジェナイズ＆超音波破砕）、②還元アルキル化(DTTとIAAを使用）、③酵素消化（トリプシンを使用）、④脱塩（Stage Tip利用）、⑤LC/MS/MS測定（ショットガンプロテオーム解析）、⑥データベース検索(MASCOT検索：データベースはSwissProtを使用）、⑦パスウェイ解析(MetaCoreを使用）である。コラーゲンの合成、分解、血管新生など、これまでの遺伝子解析と類似する病態が明らかとなった。サンプルを増やすことで、さらに病態に迫る経路を特定してゆく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

安定したタンパク抽出法および抽出バッファーを決定できたため。また、プロテオーム解析、パスウェイ解析を行い、凍結肩サンプルとコントロールサンプルでの発現量の差を解析できたため。

Strategy for Future Research Activity

上記で得られたデータの解析結果とこれまで得られたマイクロアレイデータ（遺伝子解析）の整合性を検討してゆく。また、凍結肩で増加することが明かなプロテオグリカンについて、HPLCを用いて詳細に検討してゆく。
サンプル採取が順調に行えれば、プロテオグリカンの分解酵素であるコンドロイチナーゼABCの、関節包組織の粘弾性に与える影響についても検討してゆく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度の使用額は、当初計画していたサンプル数に対してタンパク抽出法が予想よりも容易に設定出来たため、試薬を使用する量が少なかったためである。平成26年度に必要になったサンプル解析に必要な経費として平成26年度請求額とあわせて使用予定である。
繰越金については、サンプル数を増やすことによって、パスウェイ解析での病態を絞り込むのに必要な経費として、平成26年度予算とあわせて使用予定である。